慢性特発性鼻炎犬の鼻腔における宿主-微生物相互作用

慢性鼻炎（CR）は、犬においてフラストレーションのたまる臨床症状であり、その病態の理解は限られている。鼻腔や口腔のような粘膜炎症が持続する部位では、宿主と微生物の相互作用が臨床疾患の重要な原動力であると考えられるようになってきている。そこでわれわれは、次世代シーケンサーを用いてCRの犬の鼻に存在する異常を調べ、免疫およびマイクロバイオームのプロファイルを健常犬のものと比較した。宿主鼻腔細胞のトランスクリプトームはRNAシークエンシングで評価し、微生物群集は16S rRNAシークエンシングで評価した。次に相関分析を用いて、鼻腔細胞のトランスクリプトームと鼻腔マイクロバイオームとの間の有意な相互作用を同定し、CRを発症した動物においてこれらの相互作用がどのように変化するかを明らかにした。注目すべきは、CRを発症した犬において、毛様体機能に関連する複数の遺伝子の有意なダウンレギュレーションが観察されたことであり、この症候群における毛様体機能不全のこれまで発見されていなかった役割が示唆された。また、TNF-αおよびインターフェロン経路に関連する免疫遺伝子の有意な発現上昇も認められた。鼻腔マイクロバイオームもまた、CR犬において有意に変化しており、いくつかの潜在的な病原体が過剰発現していた。インターアクトーム解析により、CR犬におけるポルフィロモナス属の細菌と宿主の炎症反応の上昇との間に有意な相関があること、また毛様体機能の欠損がレンサ球菌の存在量と相関していることが明らかになった。これらの知見は、イヌのCRモデルにおける宿主-微生物相互作用に関する新たな知見を提供するとともに、鼻腔病原体と鼻腔炎症および毛様体機能不全の発症との間に因果関係が存在する可能性を示している。

はじめに

慢性鼻炎（CR）は、抗生物質、抗ヒスタミン薬、経口ステロイド薬による治療に抵抗性であることが多い、漿液性から粘液膿性（くしゃみの有無は問わない）の鼻汁が持続する（数週間から数ヵ月）犬でよくみられる疾患である。これまでの報告では、犬の慢性鼻疾患の全症例の最大24％がCRであるとされている(1 -3)。犬のCRの診断は、真菌症（アスペルギルス症）、腫瘍、異物、鼻腔解剖学的異常（口蓋裂、鼻咽頭ポリープ、狭窄）、歯周病など、鼻症状の他の原因が除外された後に行われるのが一般的である。鼻腔生検組織の病理組織学的所見では、しばしば非特異的なリンパ形質細胞性炎症が認められるが、これは疾患の重症度や治療効果とは相関しない。犬のこの疾患は、明らかな原因のない持続的な臨床症状、生検やアレルギー検査による明らかなアレルギー反応の欠如、明らかな感染症の欠如という点で、ヒトの非アレルギー性鼻炎（NAR）、特に特発性NARに類似している(4 -6)。

犬における病理組織学的所見と治療反応との間に相関がないことから、犬におけるCRの病因は、CRの原因として持続性アレルギーとの関連を示唆する2つの実験的研究(8,9)があるにもかかわらず、ほとんど不明のままである(7)。慢性鼻炎は、鼻腔生検で観察される典型的なリンパ球性免疫浸潤に基づく炎症性疾患であるが、免疫反応の性質や、その発端または永続的な原因は不明である。臨床的には、グルココルチコイド、抗ヒスタミン薬、非ステロイド性抗炎症薬、またはシクロスポリンによる治療が奏効しないことから、犬のCRのアレルギー性基盤は考えにくい(10 -12)。上部消化管の異常がCRのごく一部の犬で検出されることがあり、胃食道逆流および/またはリンパ形質細胞性消化管炎症との関連性が想定されます(13)。CRの管理は依然として困難であり、この疾患は一般的に患者、飼い主、臨床医のフラストレーションの原因となっています。したがって、CRの病態をよりよく理解することは、よりよい治療法や管理戦略を同定し、ヒトの特発性鼻炎を研究するためのイヌCRモデルを開発するために不可欠である。
毛様体ジスキネジアは、ヒトおよびイヌにおいて上気道および下気道感染を繰り返すまれではあるが重要な原因である(14,15)。繊毛の機能については、ヒトのアレルギー関連CRの研究ではこれまであまり調査されておらず、イヌの繊毛運動障害に関する報告もほとんどない(16,17)。しかし、毛様体ジスキネジアのある犬でよくみられる所見として、鼻感染症の再発がある(18)。次世代シークエンシング技術は、犬における従来の免疫組織化学的およびサイトカイン分析アプローチによってもたらされた試薬の制限を受けることなく、宿主のトランスクリプトームとマイクロバイオーム組成を調査するための偏りのないツールを提供するようになった。例えば、イヌの慢性鼻炎における鼻粘膜トランスクリプトームに関する以前の研究では、旧世代のRNAトランスクリプトーム技術（マイクロアレイ）が用いられ、重要な新情報が得られたが、今回の研究で採用されたような、現在のイルミナベースのRNAシーケンス技術によるシーケンスカバレッジの深さは得られなかった(19)。
慢性アレルギー関連CRのヒトを対象とした最近の研究では、鼻腔の局所トランスクリプトームが特徴づけられており（20、21）、このようなアプローチによって、ヒトやイヌの鼻腔炎症に関連する分子メカニズムのより包括的な検討が可能であることが明らかになっている（22）。宿主と微生物の相互作用は鼻の生態系の重要な構成要素であり、ヒトでは正常な鼻腔内マイクロバイオームの崩壊が慢性鼻炎の発症や持続に関与している可能性が示唆されている(23)。正常なイヌの鼻腔マイクロバイオームに関する先行研究(24 -27)では、支配的な菌門はプロテオバクテリア、ファーミキューテスおよびバクテロイデーテスであると報告されている。真菌性鼻炎のイヌでは、Morexella属の減少、Pasteurellaceae属の増加、Lactobacillaceae属の増加を含むdysbiotic microbiomeが報告されている(28)。慢性鼻副鼻腔炎のヒトを対象とした先行マイクロバイオーム研究から、特定の微生物の存在量が鼻炎の持続に関係している可能性が示唆されている（29）。しかし、ヒトの鼻疾患において、宿主免疫のトランスクリプトームが鼻粘膜のマイクロバイオームと直接相関した報告は、我々の知る限り1件しかない（30）。
本研究の目的は、健康な犬の鼻粘膜トランスクリプトームとマイクロバイオームを、CRを発症した犬の鼻粘膜トランスクリプトームと比較し、犬のCRの病態をより深く理解することである。我々は、CRを発症したイヌの鼻粘膜トランスクリプトームおよびマイクロバイオームが、健常イヌのそれとは有意に異なること、また、CRを発症したイヌでは、特定の細菌集団と宿主免疫応答遺伝子との間に疾患特異的な相関が同定され、健常動物で観察されたものとは有意に異なるであろうという仮説を立てた。

材料と方法

研究対象

この前向き症例対照研究では、コロラド州立大学獣医教育病院（CSU-VTH）に受診したCR犬（n=6）および健常対照犬（n=6）を対象としている。本試験のプロトコールはCSUのInstitutional Animal Care and Use CommitteeおよびCSU-VTH Clinical Review Boardの承認を得た（プロトコール#2858）。CR犬の登録基準には、片側または両側の鼻汁、鼻づまり、くしゃみの少なくとも1ヵ月間の既往が含まれた。鼻粘膜生検に基づき、好中球性または好酸球性鼻炎を伴うか伴わないリンパ形質細胞性鼻炎を組織学的に証明し、CTおよび鼻鏡検査に基づき、腫瘍、真菌感染またはCRの他の同定された原因を認めないことも、試験参加に必要であった。

除外基準には、グルココルチコイド、レフルノミド、ミコフェノレート、アザチオプリン、または細胞毒性化学療法を含む免疫抑制薬を登録前1ヵ月以内に投与されている動物が含まれた。鼻免疫を変化させる可能性のある内分泌疾患（クッシング病、糖尿病）と診断されたことのある動物も除外した。鼻出血が顕著な犬も除外した。鼻の徴候を引き起こす可能性のある他の疾患（新生物、アスペルギルス症、異物、鼻腔瘻、鼻咽頭狭窄、慢性逆流）の診断も除外基準とした。
定期的な歯のクリーニングのためにCSU-VTHに来院した動物の中から、鼻の徴候やその他の呼吸器徴候、胃腸徴候、鼻腔に影響を及ぼす可能性のある歯科疾患（鼻腔瘻など）が報告されていないn=6頭の犬を健常対照群とした。登録されたすべての動物は、綿棒採取の30日前から抗生物質を使用していなかった。

サンプル採取と処理

鼻腔スワブは、全身麻酔下で、6インチのPurFlock Ultra、滅菌フロック採取器具（Puritan Medical Products、Guilford、ME）を用いて鼻腔の遠位3分の1を優しくスワブすることにより採取した。綿棒（各鼻孔につき2本ずつ）を、RNA late（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を入れた15 mLコニカルチューブ（Corning Inc. 鼻腔細胞からRNAを抽出するため、綿棒を高速で1分間ボルテックスして細胞を破砕し、PBSを1:5の割合でRNAに加えた。細胞をペレット化し、Qiagen RNeasy micro kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いてRNA抽出を行った。

RNA配列決定

RNA濃度をNanodrop 1000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）で確認し、Novogene Corp. Inc.（カリフォルニア州サクラメント）に送り、RNA配列決定を行った。RNAの品質はAgilent 2100 Bioanalyzerシステムを用いて決定され、RIN番号（RNAインテグリティナンバー）が算出された。Novogene 社では、ポリ T オリゴ付着磁気ビーズを用いて mRNA を精製した。断片化後、ランダムヘキサマープライマーを用いて第一鎖cDNAを合成し、続いて第二鎖cDNAを合成した。末端修復、A-テーリング、アダプターライゲーション、サイズ選択、増幅、精製を経てライブラリーが完成した。定量したライブラリーをプールし、Illumina NovaSeq 6000（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）でシーケンスした。150 bpのペアエンドリードが生成され、ファイルは非多重化fastqファイルとして配信された。

配列データはPartek Flow software, version 10.0（Partek Inc. Chesterfield, MO）で解析した。生データは、アダプターを含むリード、N> 10%を含むリード、およびPhredスコア > 30のリードを除去してフィルターした。フィルターされたリードは、CanFam3.1ゲノムアセンブリを用いてSTAR 2.7.3aでアライメントされた。アライメントされたリードは、Ensembl 107を用いてHT-seq (31)を用いてアノテーションおよびカウントされ、DEseq2 (32)を用いて差次的発現遺伝子が同定された。(負の二項分布に基づく差次的遺伝子発現解析）。生物学的解釈には、遺伝子オントロジーおよび遺伝子セット濃縮解析（GSEA）が含まれた1。比較には、遺伝子セットHallmarks v2022.1、biocarta v2022.1、KEGG v2022.1、Gene Ontology go.bp v2022.1、およびImmuneSigDB v2022.1を使用した。有意なパスウェイは、偽発見率（FDR）q値≦0.25およびNOMp値≦0.05を用いてフィルタリングした。Human Protein Atlas2からの単一細胞遺伝子発現データを用いて、免疫細胞では発現しない嗅覚細胞および上皮細胞特異的遺伝子セットを同定した。
以前に発表されたヒト鼻上皮の単一細胞シーケンスデータ（33）を用いて、以前に発表されたイヌ末梢血単核球のRNAseqデータ（34）には見られなかった、鼻の細胞タイプ（分泌細胞、杯細胞、クラブ細胞、イオノサイト、毛様体細胞、急速分裂細胞RDC）に特異的な遺伝子を同定した。

微生物16S配列決定

微生物解析のためにスワブを追加採取した。綿棒は、Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kitの説明書（Qiagen, Hilden, Germany）に従って切断し、抽出チューブに浸した。微生物DNAは-80℃で凍結保存し、コロラド大学アンシュッツ・メディカル・キャンパス（コロラド州オーロラ）のアンシュッツ・センター・フォー・マイクロバイオーム・エクセレンス（ACME）に送り、微生物の塩基配列を決定した。ライブラリーはEarth Microbiomeプロジェクトのプロトコール3に従い、515Fと806Rのプライマーを用いて35サイクルのPCRを行った。サンプルはIllumina Miseqシーケンス装置のMiniSeqカートリッジで実行した。微生物配列解析はQIIME2（35）を用いて行った。微生物群集の類似性は主座標分析（PCoA）プロットで表示した。アルファ多様性はShannon、Faith、pielou指標を用いて決定した。β多様性は加重および非加重UniFrac、Bray Curtisを用いた。アルファ多様性指標はペアのt検定で比較し、ベータ多様性指標はPERMANOVAで比較した。治療群間で有意差のある配列バリアントを決定するために、ANCOM（Analysis of composition of microbiomes）を採用した(36)。さらに、線形判別分析（Linear discriminant analysis Effect Size：LEfSE）を用いて、鼻炎群と健常群4とを最もよく判別する分類群を算出した（37）。スワブサンプル中の全体的な細菌量が少ないため、各サンプルに必要なリード数に達するには、さらにPCRサイクルが必要であった。最小頻度50の微生物フィーチャーをフィルターで除去し、2サンプル以上に存在しないフィーチャーも除去した結果、合計106のフィーチャーが得られた。n=12サンプルの頻度の中央値は14,455.5、総頻度は228,553であった。

Cibersortを用いた細胞の同一性の割り当て

n=17頭のイヌ(38)の単一細胞RNA配列データを用いて、鼻腔ぬぐい液中の免疫細胞のCibersort解析用シグネチャーマトリックスファイルを作成した(39)。17頭のイヌのscRNAseq解析から以前に得られた血液中の74,067個の免疫細胞のデータを用いて、41個の転写的に異なる白血球集団が同定された。イヌの鼻腔サンプル中の白血球集団を解析するために、41の細胞集団のそれぞれをダウンサンプリングして、各細胞タイプで均等な代表を得た後、各集団の正規化カウントデータを合計して、遺伝子ごとの細胞タイプマトリックスを得た。細胞タイプ別にカウントデータを折りたたんだ後、データセットをフィルタリングして、各細胞集団を定義する最も可変性の高い特徴のみを含むようにした。フィルタリングはFindAllMarkers関数の出力を用いて行い、平均log2 fold change（他の全ての細胞に対する）が0.85より大きく、細胞集団内での発現パーセントが75%より大きい特徴を選択した。最初のフィルタリングの後、重複するフィーチャーはデータセットから取り除かれた。このデータセットは、免疫細胞タイプのエンリッチメントを決定するために、本研究の中央値比正規化カウントとともに5へアップロードされた（イヌの上皮細胞集団については同様のデータセットが入手できなかった）。

トランスクリプトームとマイクロバイオームデータのインターアクトーム解析

この解析では、有意な差次発現遺伝子（DEG）をRNAシーケンスデータから推定した。次に、個々のサンプルから得られたこれらの中央値比正規化リードを、rcorr（Rstudio）（40）を用いて、n= 12サンプル（健常および鼻炎）で見つかった160のユニークな細菌分類群の相対存在量パーセントと相関させた。有意性のp値と相関のr値は、各遺伝子と分類群のペアについて作成した。相関のp値が0.05以下のタンパク質コード遺伝子は、タンパク質セットを分類するためにstring proteindatabase6(41)に入力された。

データの利用可能性

この原稿で紹介したfastqファイルとリードカウントを含むRNAシーケンスデータは、NCBIのGene Expression Omnibusに寄託されており、GEO Seriesのアクセッション番号GSE255529からアクセスできる。その他のデータはすべて、妥当な要求があれば対応する著者から入手可能である。

結果

研究集団とCRとの関連性

鼻のトランスクリプトームとマイクロバイオームがCRの犬でどのように変化するのかという疑問に取り組むため、我々はn= 6頭の健常犬とn= 6頭の少なくとも1ヶ月のCRの犬から採取した鼻腔深部スワブサンプルの塩基配列を決定する前向き研究を計画した。CR犬と健常犬の人口統計学的データを表1、2に示す。本研究は年齢と性別をほぼ一致させたが、健常犬はCR犬より全体的に若かった。CR群では、臨床徴候の重症度は軽度からびらん性、より重篤なCRまで幅があった（表1）。

表1

表1. 慢性鼻炎犬の人口統計学的データ。

表2

表2. 健常対照犬の人口統計学的データ。

鼻腔トランスクリプトーム解析により、好酸球の減少とともに、慢性鼻炎の犬における免疫および上皮遺伝子の発現に顕著な違いがあることが明らかになった。

本研究で取り上げた最初の疑問は、上皮細胞、免疫細胞、間質細胞を含む鼻粘膜細胞のトランスクリプトームが、健常犬と比較してCR犬で有意に異なるかどうかであった。12個の解析サンプルにおいて、合計17,975個のタンパク質コード遺伝子が同定された。n=6のCR犬からのサンプルは、n=6の健常犬と比較して明確なクラスタリングを示し（図1A）、CRサンプルには高度なトランスクリプトームの不均一性が存在した。対照的に（図1B）、健康な鼻のトランスクリプトームは比較的高いレベルのサンプル内均一性を示した。次に、CRトランスクリプトームと健常トランスクリプトーム（既知のアノテーションを持つ14,504のタンパク質コード遺伝子の解析に基づく）を比較して、遺伝子発現差（DEseq）解析を行った。その結果、フォールドチェンジ（FC）≧2Log2、FDR調整p値≦0.05の有意な発現上昇遺伝子が234個見つかった。解析の結果、FC≦2Log2、FDR≦0.05で、発現が有意にダウンレギュレートされた遺伝子も385個見つかった（図1C）。CRサンプルで最も発現が上昇した遺伝子には、OXER1、OSM、PROK2、MMP8、TEX48をコードする遺伝子が含まれ、発現が最も低下した遺伝子には、OR7G6、CDKL4、SNTN、DZIP1L、LMNTD1が含まれた（図1D）。発現量の異なる免疫関連遺伝子（DEG）のパスウェイ解析により、CR動物ではTNF-α経路やIFN-γ経路、IFN-α経路などの炎症性経路のアップレギュレーションが、CR犬では細胞周期（CTCF）やアクチビン受容体キナーゼ（ALK）、TGF-β経路の有意なダウンレギュレーションとともに明らかになった（図2A）。

図1

図1. 鼻腔スワブ細胞のRNA配列決定。鼻炎が確認された犬6頭と健常犬6頭から採取した綿棒でトランスクリプトーム解析を行った。 A）鼻炎サンプル（赤）と健常サンプル（青）のPCAプロットで、17,975遺伝子が検出された。(B)0.42から1までの値を赤いグラデーションで表したサンプルの類似性指数。C） n=6鼻炎サンプルとn=6健常サンプルのDEseq解析から得られた有意遺伝子のボルケーノプロット。赤い点は、フォールド変化>2Log2、FDR≤0.05で定義される有意な遺伝子を示す。青い点は、fold change <-2Log2, FDR ≤00.05で定義される有意に発現低下した遺伝子を示す。(D)有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた上位20遺伝子のリスト（鼻炎対健常）。

図2

図2. 鼻トランスクリプトームのパスウェイと細胞タイプ解析。(A)HallmarksおよびBiocartaパスウェイを用いたGSEA解析結果。NES（正規化濃縮スコア）により整理された有意なパスウェイは、マイナス3から3までのX軸に示される。FDR調整p値はカラースケールで示され、円の大きさは表された全遺伝子を示す。(B)CRとHCの比較で有意な発現差を示した鼻上皮特異的遺伝子。ドットの大きさは正規化発現を示し、x軸はDeseq fold change結果を示す（CR vs. HC）。カラースケールはFDR調整p値（すべて<0.05）。(C)繊毛に関連する有意なGSEAパスウェイ、CRではすべてダウンレギュレーション、正規化濃縮スコア(NES)をx軸に示し、パスウェイ内の全遺伝子をドットサイズで表す。(D)Cibersortを用いて、イヌの鼻炎または健常サンプルで発現している細胞タイプを定義し、それぞれ赤と青で示した。17,975のタンパク質コード遺伝子のトランスクリプトーム数を正規化して解析に用いた。疾患群と健常群間の有意性は、Bonferroni多重比較検定を用いた二元配置分散分析を用いて算出した。X軸は、メソッドに記載されているように、単一細胞のトランスクリプトームデータによって定義された細胞タイプを示し、点線は10％の全細胞集団を示す。(C）鼻上皮特異的遺伝子のドットプロット。大きさはノーマライズした発現値（平均n= 11）、FDRp値は色で示す（すべて<0.05）。

上皮細胞の機能不全もCRの病因に重要な寄与をする可能性があるため、研究対象犬の上皮細胞トランスクリプトームも解析した。この解析を行うために、ヒトの単一細胞データベース(33)を検索し、粘液・漿液腺細胞、唾液管細胞、繊毛細胞、扁平上皮細胞に関連する遺伝子を含む上皮細胞特異的遺伝子を調べた。我々の解析では、イヌの白血球が発現する遺伝子も除外した（34）。この解析から、CRの犬で発現が有意に低下している繊毛気道細胞機能に関連する遺伝子が多数（合計117個）存在することがわかった（補足図S2A,B）。さらに、繊毛および鞭毛関連タンパク質、ムチンおよび嗅覚受容体に関連する遺伝子も、他の鼻上皮特異的細胞タイプによって発現される遺伝子とともに、発現低下していた（補足図S2C）（図2B）。毛様体の集合、運動および制御に関連する経路も、CRを発症したイヌのサンプルで発現が低下していることが判明した（図2C）。これらの所見は、毛様体の機能不全と気道粘液および残渣のクリアランス不全が、イヌのCR発症に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。しかし、今回の研究では、毛様体機能不全がCRを発症した犬における一次的なものなのか、二次的なものなのかを明らかにすることはできなかった。
バルクトランスクリプトーム解析に加えて、イヌの単細胞白血球シーケンスデータから作成したCibersortマトリックス（38）を用いて、本研究の鼻腔スワブから得られたバルクRNAseqデータを特定の免疫細胞集団由来の遺伝子セットに分解した。Cibersort解析を用いて、健康な犬とCRを発症した犬の12個のRNAseqサンプルから、合計23の異なる免疫細胞集団を同定した。その結果、多形核-骨髄由来抑制細胞（PMN-MDSC）の割合は、健常犬と比較してCRの犬の鼻腔ぬぐい液で有意に高く、一方、予想外に好酸球の割合は、健常犬と比較してCRの犬で有意に低いことがわかった（図2D）。

鼻腔マイクロバイオームの解析により、CRの犬では健常犬と比較して有意差があることが明らかになった

微生物の16S rRNA配列決定により、鼻腔スワブサンプルに160のユニークな分類群が存在することが明らかになった。細菌集団の全体的な多様性をグループ間で評価するために、αおよびβ多様性をCRと健常なサンプル間で比較したところ、α多様性にはfaithまたはShannonメトリクスのいずれを用いても有意な差は認められなかった（図3A,B）。しかし、β多様性はCR検体と健常検体で有意な差があり、Bray Curtis β多様性でも、UniFrac距離測定でも、CR検体と健常検体のクラスターは明確に分かれていた（図3C,D）。これらの解析から、CRの犬の鼻には細菌叢が存在することが示唆され、これは以前に報告されている(24)。

図3

図3. 健常時と鼻炎時のマイクロバイオームのαおよびβ多様性解析。(A）鼻炎と比較した健常（青色）のフェイスα多様性指標。系統的多様性（PD）ノンパラメトリックMann Whitneyt-検定を用いて統計的差異を比較。正確なp値をグラフに示す。(B）健康または鼻炎のマイクロバイオームのシャノン多様性指標。(C)β多様性比較のために作成した3D Bray Curtis β非類似度pCoAプロット。健康なサンプルは青、鼻炎のサンプルは赤で表示。表は健常サンプルと鼻炎サンプル間の有意差のp値を示す。(D)β多様性比較のために作成した3D重量UniFrac PCoAプロット。有意なp値は下表に示す。

鼻炎犬と健常犬の鼻で同定された11門のうち、最も多かった門は健常犬ではプロテオバクテリア門、鼻炎犬ではファーミキューテス門であった（図4A）。ANCOM解析の結果、4つの門がCRの犬と健常な犬の間で相対的な存在量に有意な差があることがわかった（図4C）。これらのうち、Proteobacteriaと GN02はCRの犬で有意に存在量が多く、一方、Firmicutesと Actinobacteriaは健常犬と比較してCRの犬で有意に存在量が少なかった（図4C）。

図4

図 4. 鼻炎および健常鼻のマイクロバイオームにおける微生物分類学的分布。(A）積み重ね棒グラフで表した門レベルの分類学。健常サンプルと鼻炎サンプルは一緒にグループ化されている。色は各門の相対的存在率を示し、ラベルは右側に示す。(B）クラスレベルの分類を積み上げ棒グラフで表したもの。(C)ANCOM分析によるボルケーノプロットで、健常者と鼻炎患者を比較したもの。Y軸の W値は、帰無仮説が棄却された回数を表す。X軸の値は、相対存在量の差を中心対数比（clr）変換した平均値を表す。健康なサンプルで有意に発現が増加した門を赤で、有意に発現が減少した門を青で示す。(D)クラスレベルでのANCOM差分存在量ボルケーノプロット。(E)健康（青）と鼻炎（赤）の間で有意に異なる分類群存在量のLDAスコアリングを示すLefSEeの結果。オレンジ色のハイライトは、ANCOMでは発見されなかったユニークな属レベルの違いを示す。

16のクラスレベルの分類群が同定され、最も豊富なクラスは健康な犬ではGammaproteobacteria、鼻炎の犬ではBacillusであった（図4B）。ANCOM分析により、これらの最も豊富な細菌クラスについて、CR犬と健常犬との間に有意差が認められた（図4D）。線形判別分析Effect Size（LEfSe）もまた、細菌集団の差異を調べるために使用され、この分析により、CRサンプルに存在する変化した粘膜細菌集団に有意に寄与する、さらなる科および属レベルの差異が明らかになった。例えば、キチン食菌科の Arthrobacterと KingellaはCR群で相対的存在量が高かったが、健常対照群ではマイコプラズマ科の相対的存在量が高かった（図4E）。

インターアクトーム解析により、イヌ鼻粘膜における細菌集団と宿主免疫応答および繊毛経路との有意な相互作用が明らかになった。

最後に、鼻のトランスクリプトームとマイクロバイオームのデータを用いて、宿主の鼻の反応と微生物集団の間の潜在的な相互作用をよりよく理解するための相互作用マッピングを開発した。まず、トランスクリプトームデータからDEG（図1参照）を選択し、619の差次発現遺伝子の正規化発現値を160の細菌分類群の相対存在割合と相関させた。この解析の結果、鼻の宿主遺伝子502個が、少なくとも1つの細菌分類群と有意な相関（p≦0.05）を示した。

Enterococcus属、Streptococcus属、Helcococcus属、Porphyromonas属、Arthrobacter属を含む5つの細菌属が、15の発現差のある遺伝子と有意な相関を示した（図5A）。これらの相互作用の可能性のある遺伝子をStringタンパク質データベースに入力し、意味のあるつながりや相互作用を探した。タンパク質ネットワークの関連は、5つの細菌属のうち3つの属で宿主遺伝子セットの濃縮を示した。興味深いことに、Porphyromonasと Arthrobacterと相関する遺伝子セットは、複数の免疫経路にマップされた（図5B,C）。対照的に、連鎖球菌と相関する遺伝子セットは、主に運動性と細胞骨格構造に関連する遺伝子に関与しており、その中にはCR犬でダウンレギュレートされることが判明した毛様体経路の多くも含まれていた（図5D）。このように、我々のインタラクトーム解析は、免疫および鼻上皮細胞応答と、以前に病原体として同定されたいくつかの細菌（例えばポルフィロモナス）を含む特定の細菌集団の両方が関与する、宿主と細菌のいくつかの重要な相互作用を明らかにした。

図5

図5. 犬鼻炎の遺伝子ベースのインタラクトーム。トランスクリプトームとマイクロバイオーム間の相互作用（インタラクトーム）。有意なDEG（合計637）遺伝子を用いて、タクソンの存在量と正規化遺伝子数の相関を行った。(A)15以上の有意な遺伝子相関を持つ属レベルの5分類群を示す。X軸は有意に相関のある遺伝子の総数。(B-D)String.dbを用いて、各5属の相関遺伝子の遺伝子セット濃縮度を求めた。(B) ポルフィロモナスと正の相関を持つ84遺伝子のGO、KEGG、reactomeを含む分類結果を示す。右上の凡例、有意なFDRp値は逆対数スケール（紫色）、パスウェイにマッチした総遺伝子数は青色、シグナル強度の測定値は緑色。(C)arthrobacter属と有意な正の相関を持つ92遺伝子のカテゴリー化結果の棒グラフ。(D）連鎖球菌属の存在量と有意な相関を示した185遺伝子のカテゴリー化結果の棒グラフ。

考察

本研究において、我々はCR発症犬の鼻粘膜トランスクリプトームとマイクロバイオームを解析し、本症候群の病因の解明と宿主-微生物相互作用の明確化に役立てた。その結果、CRを発症したイヌでは、毛様体および鞭毛の機能に関連する複数の遺伝子の発現が有意に低下しており（図1）、毛様体機能不全が本症候群の病因に大きく関与している可能性が示唆された。また、CRを発症した犬では、TNF-αやI型およびII型インターフェロンが関与するインターフェロンシグナル伝達経路など、複数の炎症経路がアップレギュレートされていた。

我々の知る限り、本研究は、宿主の免疫応答と粘膜マイクロバイオーム集団の相互作用をイヌで調べた初めての研究でもある。インタラクトーム解析の結果、CRを発症したイヌでは鼻腔細胞と病原微生物ポルフィロモナスとの間に有意な相互作用が認められ、イヌやヒトの歯科疾患について以前に報告されているこの微生物が原因的役割を担っている可能性が示唆された(42,43)。インターアクトーム解析でも、レンサ球菌と毛様体機能不全との間に有意な相互作用が同定され、ここでも強い関連性とCRにおける原因的役割の可能性が示された。これらの知見は、鼻、咽頭、上気道、女性の生殖管などの粘膜炎症部位における微生物と宿主の反応相互作用の解明に、次世代シーケンサーを応用することの有用性を示している。さらに、今回の知見は、犬のCRを管理するために、標的化抗菌薬療法や局所適用免疫療法など、新しい独創的な治療介入の可能性を示唆している(44,45)。
さらに驚くべき知見として、CRを発症した犬では、毛様体および鞭毛の機能に関連する遺伝子の発現が明らかに広範囲にわたって低下していることが明らかになった。これらの所見は、犬のCRにおける粘液クリアランス機構の重大な機能障害を示唆している(46,47)。遺伝性毛様体ジスキネジアを有するヒトおよびイヌは、臨床的に管理が困難な上気道感染症および下気道感染症を繰り返す(16,18,46)。本研究では、毛様体機能不全がイヌにおけるCRの主原因であるのか、あるいは機能不全が持続的な鼻腔炎症と一過性または永続的な繊毛の喪失に起因する二次的な病理であるのかを決定することはできなかった。例えば、炎症が毛様体機能不全を誘発することが報告されており、シュードモナス属などの特定の細菌が産生する毒素も同様である(46,48)。いずれにせよ、粘液や病原体の毛様体クリアランス障害は、CRの病因の重要な一部である可能性がある。
免疫トランスクリプトーム解析の結果、OXER1がCRを発症した犬の鼻粘膜で最も発現が増加した唯一の免疫遺伝子であることが明らかになった。この遺伝子は炎症に関与しており(49)、好中球や単球の遊走に重要な役割を果たしている。CRの犬の鼻で有意に発現が上昇した他の遺伝子には、OSM、MMP8、IL-18RAPがあり、それぞれ粘膜炎症と関連している(50,51)。注目すべきことに、OSMとOSMRは、ヒトの炎症性腸疾患において調節異常となる重要な免疫経路であることが報告されている(52)。さらに、好中球の遊走に関連するCSF3RとSELLという遺伝子の発現がCRのイヌで上昇し、ヒトの鼻上皮細胞における炎症反応を媒介することが示されている(53)。このような所見は、副腎皮質ステロイド療法がほとんど無効であるという事実にもかかわらず、CRの管理におけるフザプラジブのような白血球機能抗原-1（LFA-1）阻害剤の治療的役割の可能性を示唆しているかもしれない。
驚くべきことに、今回の研究では、DEG解析や免疫経路解析のいずれによっても、CRの犬におけるアレルギー反応の存在を示唆するトランスクリプトームの証拠は認められなかった。その代わりに、CRの犬で主に発現が増加した経路は、IFN-γ、IFN-α、TNF-αおよびROS経路であり、これらはすべてTh1免疫活性化経路と一致していた。さらに、Cibersort分析によると、好酸球はCRの犬の鼻で有意に減少していた。これらの所見は、ヒトの特発性CRで報告されていることと一致し、イヌのCRに対する副腎皮質ステロイドおよび抗ヒスタミン薬による管理で臨床的利益が得られないこととも一致する(54)。加えて、毛様体および嗅覚遺伝子の発現のダウンレギュレーションは、少なくとも部分的には上皮表面の機能不全によって媒介される、CR発症の機械的側面を示唆している。イヌのCRをさらに細分化し、本研究で報告された知見を確認するためには、より大規模なイヌのCR患者集団におけるトランスクリプトームパターンのさらなる調査が必要であろう。
CRを有する犬の鼻腔の微生物叢の変化は以前に報告されており、ある研究では、主にモラクセラ（Moraxella）ファミリーの存在量の減少によって、プロテオバクテリア（Proteobacteria）の相対的存在量の減少が報告されており(19)、これは本研究の所見と一致する。Tressら(24)は、イヌのCRサンプルにおいて、Proteobacteria属の減少およびBacteroides属の増加が報告されている。興味深いことに、ヒトの鼻疾患プロセスの病原菌として知られるS. aureusと S. pneumoniae（55）は、今回の研究ではCRマイクロバイオームへの有意な寄与者として同定されなかった。
本研究で行われたインタラクトーム解析は、CR犬の病態に及ぼす細菌異常症の潜在的影響を理解する上で重要な背景を提供した。マイクロバイオーム解析だけでは疾患メカニズムに関する知見は比較的乏しいが、宿主の反応をマイクロバイオーム解析に組み入れることで、新たな重要な関連性が見出される可能性がある。例えば、最近のいくつかの研究では、小児喘息における上気道マイクロバイオームとトランスクリプトームの相互作用が調べられている(56 -60)。イヌでは、P. gingivalisが歯周病との関連でイヌの病原菌として同定されている（61）。さらに、ポルフィロモナスはヒトの肺マイクロバイオームの中核をなす構成要素として認識されつつある(62)。これまでの研究で、P. cangingivalisおよびP. canorisにおけるヘムおよびイオン輸送関連遺伝子との関連が示されており、前者はイヌの口腔内で最も豊富な細菌であった(61)。今回の研究では、ポルフィロモナスと正の相関を示した81の宿主遺伝子のうち、最も高い相関を示した3遺伝子（CSF-1、CCL3、FPR2）はすべて宿主の炎症反応に関与する遺伝子であった。
CRを発症した犬では、ポルフィロモナスと宿主の免疫応答との間に有意な相互作用が観察されたにもかかわらず、ポルフィロモナスの全体的な存在量は健常動物とCR動物の間で有意な差は認められなかった。この所見は、鼻腔内のポルフィロモナス菌の相対的な存在量が免疫応答の主な原動力ではなく、むしろポルフィロモナス株の相対的な病原性が、特に抗生物質の圧力（63）または劇症株や亜株の存在（64）の影響下で、鼻腔内コロニー形成の時間の経過とともに進化する可能性があることを示唆している。しかし、ポルフィロモナスの存在量が多かった2頭のCR犬では、好中球浸潤が増加していた。これらの初期所見から、ポルフィロモナスは歯科疾患の発症における既知の役割に加えて、犬の鼻における日和見病原体として機能している可能性が示唆される。
ヒトの喘息患者を対象とした以前の研究では、鼻腔検体中のレンサ球菌数の有意な増加が認められ、健常対照群と比較して喘息児では毛様体機能遺伝子のダウンレギュレーションが認められた(59)。同様に、イヌのCRにおいても、レンサ球菌と毛様体機能遺伝子との間に有意な相互作用が観察された。また、レンサ球菌の存在は、毛様体細胞の構造と運動性に関連することが知られている宿主遺伝子（ダイニン、チューブリン、ATP繊毛）の発現のダウンレギュレーションと相関していた。これらの所見を総合すると、ポルフィロモナスとレンサ球菌の両方が犬のCRにおける毛様体機能障害と関連していることが示唆され、実際にこれらの細菌が犬のCRにおいて原因的な役割を果たしている可能性が示唆された。
本研究の主な限界は、各集団のサンプルサイズが小さいことであり、これは偽の疾患と微生物の関連につながる可能性がある。また、サンプル数が少ないために、犬のCRにおける免疫と微生物の変化の複雑さを過小評価している可能性もある。しかしながら、サンプル数が少ないにもかかわらず、我々はCRの犬における宿主応答とマイクロバイオーム集団の両方における有意かつ一貫した差異を同定することができた。さらに、健常対照群の年齢中央値は、CR犬と比較して有意に低かった（5歳対9.75歳）。ヒトのCR患者における加齢に伴う微生物の変化については前例があるが(65)、犬のCR群のサンプルサイズは小さすぎたため、高齢のCR犬と若いCR犬との比較はできなかった。
要約すると、本研究は、CR犬の鼻腔内で生じる宿主と微生物の相互作用について新たな知見を提供するものである。特に注目すべきは、CR犬における毛様体機能不全の広範な証拠と、アレルギー性炎症の証拠の欠如であった。したがって、これらの新たな知見は、CRと犬におけるアレルギーの役割の再考を示唆し、CRの病因の理解を、本疾患における病原体の潜在的役割に焦点を絞り直す必要性を示している。インタラクトーム解析は、鼻腔内の潜在的な病原体と持続的な鼻腔内炎症との間に重要なつながりがあることを示す初期の証拠となった。このような知見が確認されれば、抗生物質の経鼻投与を含む標的抗菌薬療法や、病原性ビオンを標的としたワクチンの使用に道を開く可能性がある。別のアプローチとして、鼻腔病原体に対する宿主免疫応答を強化または変化させるために、局所に送達される自然免疫活性化免疫療法を用いることも可能である（45,66）。

データ利用声明

本研究で発表されたデータは、GEOリポジトリ（アクセッション番号GSE255529）に登録されている。

倫理声明

動物実験は、CSU Institutional Animal Care and Use CommitteeおよびCSU-VTH Clinical Review Boardの承認を得た。研究は、現地の法律および施設の要件に従って実施された。本研究に動物を参加させるにあたり、飼い主から書面によるインフォームドコンセントを得た。

著者貢献

ZW：概念化、データキュレーション、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、検証、視覚化、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。LC: 概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。SDa：データキュレーション、正式分析、方法論、執筆-原案、執筆-校閲・編集。RI：調査、方法論、執筆（原案）。AM：執筆-原案、執筆-校閲・編集。SDo：概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、視覚化、執筆-初稿、執筆-校閲・編集。

資金提供

著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために財政的支援を受けたことを宣言する。本研究は、医学部内部資金（SD）の支援を受けた。

謝辞

CSU内科技術スタッフおよびCSU歯科スタッフによる重要な研究支援に感謝する。また、試料調製にご協力いただいた栗原翡翠氏、犬用Cibersortマトリックスの作成にご協力いただいたDylan Ammons博士に感謝する。

利益相反

著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注

本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者らのものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料

本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1385471/full#supplementary-materialに掲載されている。

補足図S1｜CRおよび健常人サンプルからのTH1およびTh2遺伝子のヒートマップ。高発現（赤）から低発現（青）までの遺伝子発現レベル。
補足図S2｜毛様体細胞遺伝子のヒートマップ。(A,B）CRの犬で有意に発現低下した鼻上皮に特有の毛様体細胞遺伝子。(C）"繊毛、嗅覚、ムチン、またはケラチノサイト "に関連するキーワードを持つ追加遺伝子。

脚注

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キーワード：犬、マイクロバイオーム、鼻、免疫、繊毛、サイトカイン
引用 Wang Z, Chow L, Das S, Impastato R, Manchester AC and Dow S (2024) 慢性特発性鼻炎犬の鼻腔における宿主-微生物相互作用。Front. Vet. Doi: 10.3389/fvets.2024.1385471.
受理された： 2024 年 2 月 12 日;受理:2024 年 7 月 22 日；
発行：2024年8月12日

編集者
アイザック・カリミ、ラジ大学、イラン

査読者
Yun Tian, マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部, 米国
ジョージ・グラント（英国、アバディーン、独立研究員

Copyright© 2024 Wang, Chow, Das, Impastato, Manchester and Dow. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責スティーブン・ダウ、sdow@colostate.edu

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