短いtRNAアンチコドン幹と変異型eRF1が停止コドンの再割り当てを可能にする
公開日: 2023年1月11日
短いtRNAアンチコドン幹と変異型eRF1が停止コドンの再割り当てを可能にする
Ambar Kachale, Zuzana Pavlíková, ...Julius Lukeš 著者名を表示する
Nature (2023)この記事を引用する
22 Altmetric
メトリクス詳細
概要
標準的な遺伝暗号に従って、認識tRNAは特定のアミノ酸を翻訳中のリボソームに送り、認識tRNAを持たない3つのコドンは停止コドンとして機能する。原生生物の中には、この基本原則を無視して、すべての停止コドンをセンスコドンに振り分けているものがある1,2,3,4。我々は、トリパノソーマの一種であるBlastocrithidia nonstopの7,259個のタンパク質コード遺伝子のフレーム内停止コドンを分析した。この種では、フレーム内停止コドンは高レベルで発現する遺伝子にあまり存在せず、UAAが唯一の終止コドンとして機能していることが明らかにされた。UAGとUAAの同族である新しいtRNAGluがこれらの停止コドンを再配置するために進化したのに対し、UGAの再配置はtRNATrpCCAのアンチコドン茎を5塩基対から4塩基対に短縮することによって別の道をたどった。5塩基対の標準的なtRNATrpは、遺伝暗号によってUGGを認識するが、4塩基対の短縮型は、トリプトファンもインフレームのUGAに取り込んでしまうのである。B. nonstop、Trypanosoma brucei、Saccharomyces cerevisiaeから両バリアントを導入し、この2つの種で発現させると、すべての4-bpバリアントで著しく高いリードスルーを記録することができた。さらに、B. nonstop release factor 1をコードする遺伝子は、UGAの認識を特異的に制限する変異を獲得し、UGAの再割り当てを強力に促進した。また、繊毛虫のCondylostoma magnumもほぼ同じ戦略をとっている。このように、真核生物と無関係の生物で、停止コドンが再割り当てされた場合に利用される、これまで知られていなかった普遍的なメカニズムを説明することができる。
データの利用可能性
この研究で作成されたすべてのデータは、この論文（およびその補足情報ファイル）に含まれています。MSデータはPRIDE54パートナーリポジトリを通じてProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子PXD033324で寄託されています。高スループットシーケンスデータセットは、PRJNA790628の番号でNational Center for Biotechnology Informationに寄託され、Figshare55に掲載された。追加データおよび解析結果はFigshare56に掲載されています。ソースデータは本論文に添付しています。
コードの入手
このプロジェクトのために作成されたカスタムコードは、Zenodo57で公開されています。
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また、"Seraff/blasto "プロジェクトでは、"Blastocrithidia "プロジェクトのアノテーターとユーティリティを提供しています。Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.7116082 (2022)。
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参考文献のダウンロード
謝辞
M. Tesařová (Institute of Parasitology) には電子顕微鏡を、O. Namy (Université Paris-Sud) には eRF1 変異株を、D. Potěšil と Z. Zdráhal (CEITEC) には MS 分析でお世話になった。この研究は、チェコ科学財団の助成金 18-15962S および 22-14356S（J.L. と V.Y. に）、20-11585S（Z. Paris に）および 20-00579S（L.S.V. に）、チャールズ大学助成機関プロジェクト GAUK 1192819（Z. Pavlíková に）、チェコ教育省 ERD Funds 16_0000759（V.Y., Z. Paris と J.L. に）、ゴードン＆ベティ ムーア財団 GBMF no. 9354（J.L.へ）、チェコ科学アカデミーによるPraemium Academiae助成金（L.S.V.へ）。支援サービスは、プロジェクトLM2018140、ERD Funds 18_046/0015974、Czech BioImaging LM2018129 から提供された。
著者情報
著者ノート
アンナ・ネナロコヴァ（Anna Nenarokova
現在の住所 英国ブリストル大学バイオサイエンス学部
エバ・ホラコバ
現住所 チェコ科学アカデミー微生物学研究所、チェコ共和国トゥシェボニ
これらの著者は等しく貢献した。Ambar Kachale、Zuzana Pavlíková、Anna Nenarokova
著者と所属
チェコ科学アカデミー生物学センター寄生虫学研究所、チェコ共和国、チェスケー・ブディエヨヴィツェ
Ambar Kachale, Anna Nenarokova, Ignacio M. Durante, Kristína Záhonová, Serafim Nenarokov, Jan Votýpka, Eva Horáková, Zdeněk Paris & Julius Lukeš
南ボヘミア大学理学部、チェコ共和国、チェスケー・ブディエジョヴィツェ
アンバー・カチャレ、アンナ・ネナロコヴァ、セラフィム・ネナロコフ、ズデニェク・パリ、ジュリアス・ルケシュ
チェコ科学アカデミー・微生物学研究所（チェコ・プラハ
ズザナ・パヴリコヴァー、アドリアナ・ロイトヴァー、ペトラ・ミレティノヴァー、ペトラ・ベズノスコヴァー、レオシュ・シバヤ・ヴァラシェク
チェコ共和国、プラハ、カレル大学、BIOCEV、理学部
クリスティナ・ザホノヴァー＆ヤン・ヴォティプカ
オストラバ大学理学部ライフサイエンス研究センター（チェコ共和国、オストラバ市
クリスティナ・ザホノバ & ビャチェスラフ・ユルチェンコ
Thermo Fisher Scientific, Franklin, MA, USA
ロバート・L・ロス
寄稿
A.N., E.H., Z. Paris, L.S.V. and J.L. は研究の着想と設計を行った。A.K., Z. Pavlíková, A.N., J.V., A.R., P.M., K.Z., S.N., I.M.D., E.H., R.L.R., V.Y., P.B. and Z. Parisは実験を実施しデータを分析した。A.N., Z. Pavlíková, Z. Paris, L.S.V. and J.L. wrote the manuscript. L.S.V.は主担当として、完成・投稿し、修正・制作を担当した。
対応する著者
Zdeněk Paris, Leoš Shivaya Valášek, Julius Lukešに連絡すること。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利益を宣言していない。
査読
査読情報
Natureは、Pavel Baranov氏、Olivier Namy氏、およびその他の匿名の査読者の方々に、この論文の査読に貢献いただいたことに感謝します。査読者のレポートがあります。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
Extended Data 図と表
Extended Data 図1 Blastocrithidia nonstop sp.nov の形態。
光学顕微鏡(1-9)、走査型電子顕微鏡(10-12)、透過型電子顕微鏡(13-20)。DAPI染色（1-3）およびギムザ染色（4-9）した培養細胞（1-6）と宿主昆虫の後腸からの寄生体（7-9）。培養細胞ではプロマスチゴート鞭毛虫（P）が優勢であり（1, 4, 10-11）、昆虫の腸ではエピマスチゴート（E）が多いが（7-9）、培養細胞にも存在する（4）。嚢子状のアマスチゴテ（C）は培養と宿主由来の塗抹標本に存在する（9）。核とキネトプラストDNAをそれぞれ矢印と矢頭で標識している。走査型電子顕微鏡写真では、プロマスチゴート（10）と嚢胞状アマスチゴート（11および12）では、鞭毛の長さが非常に変化していることがわかる。縦断面では、深い鞭毛ポケット（FP；13および18）、楕円形の核（N）、細長いミトコンドリア（Mt）、楕円形のグリコソーム（Gl）、多数の密な酸性カルシソーム（矢頭；18）が観察される。外鞭毛の横断面 (15) と縦断面 (16) には、顕著なパラ鞭毛ロッド (PR; 13 と 18 も参照) があり、鞭毛ポケット内の部分 (14; 13 と 18 も参照) には存在しない。細くて広いキネトプラストDNAディスク（K；13, 17, 18）、細胞質内のウイルス様粒子（V；19）、規則正しく並んだ細胞内微小管（SM；13）、シスト状のアマスティゴート（20）にも注目。スケールバー 10 µm (1, 4, 7-9, 10), 5 µm (2, 3, 5, 6, 11), 1 µm (12, 13, 18, 20), 200 nm (14-17), 100 nm (19); 3回繰り返し、同様の結果を得た。
Extended Data 図2 ブラストクリシダイアの祖先における18S rRNA系統樹とAT変異シフトの結果。
(a) 18S rRNAを用いたトリパノソーマ科の最尤系統樹。属間関係を強調するために、枝は属レベルで折りたたまれている。アスタリスクは統計的に最大限の支持を得た枝を示す（最尤ブートストラップ値>90；ベイズ事後確率>0.95）；ダブルクロスの枝は元の長さの50％；スケールバーは部位ごとの置換数を示す。リーシュマニア亜科はクリシディア属，リーシュマニア属，レプトモナス属に細分化される。Blastocrithidia属は赤で強調し、主要な昆虫宿主および/またはベクター（ノミ、ハエ、カメムシ）はピクトグラムで描き、ヒトや植物に感染する3つのジクセン属は太字で示しています。また、早発停止したmRNAを除去するナンセンス媒介性崩壊経路の重要な構成要素（UPF1、UPF2）の存在を樹上にマッピングしている。この経路は、トリパノソーマ属が分離した後、トリパノソーマの前身となる系統によって失われた。(b)ブラストクリシディアの祖先におけるAT変異シフトの可能な結果を示すスキーム。すなわち、ゲノム全体がATに富む、遺伝子間領域がATに極めて富み、TAAコドンが頻繁に出現する、フレーム内停止コドンが出現する、などである。UAGからUAA、UGAからUAAへの置換は進化的に中立であるが、TGGからTGA、GAGからTAG、GAAからTAAへの置換は許容される。
ソースデータ
Extended Data 図3 B. nonstopのプロテオーム解析と構造アノテーションの原理。
(a) B. nonstopの停止コドン再配置のプロテオーム解析による証明。質量分析（MS）解析で同定されたペプチドで覆われた3つのフレーム内停止コドンをすべて含む4つのタンパク質コード遺伝子が選択された。ストップコドンを含むヌクレオチド配列を赤で示し、その概念的な翻訳を示した。その下に、同定されたペプチドを薄ピンク色でハイライトしている。配列の上に、同定されたペプチドのMSスペクトルが示されている。同定されたペプチドはすべてfigshare58で公開されている。(b) B. nonstopの構造アノテーションの原理。B. nonstopの遺伝子は、トランスクリプトームカバレッジ、トランススプライシング部位、および参照トリパノソーマティドのタンパク質のアラインメントから推測される証拠の組み合わせに基づいて予測された。詳細なプロトコルは、Methodsを参照。
Extended Data 図4 GOエンリッチメント解析とUAA純正ストップコドンを持つブラストクリシディア転写産物。
(a) 再配置されたストップコドンを欠く遺伝子のGOエンリッチメント分析。円グラフは、B. nonstopの228のタンパク質の予測される機能を、再割り当てされたストップコドンを除いてまとめたものである。(b) Blastocrithidia sp. ex Lygus hesperusの転写産物において、UAAは唯一の本物のストップコドンである。図は、以前から未熟末端が予測されていたBlastocrithidia sp.のオープンリーディングフレーム。B. nonstopとのアラインメントにより、いずれも次のUAAストップコドンまで伸長可能であることがわかった。ヌクレオチドの同一性は、黒地に白のフォントで強調されている。
ソースデータ
Extended Data 図5 B. nonstop転写産物の3′UTRにおける3つのコーディングフレームでのコドンの分布。
このグラフは、3つのコーディングフレームで計算した1,569個のB. nonstop転写産物の停止コドン後の100トリプレット（300 nt）中の64個のコドントリプレットのそれぞれの要約カウントを示す。フレーム1は遺伝子コードフレームに対応し、フレーム2と3はそれぞれ1ヌクレオチド、2ヌクレオチド分ずれている。
Extended Data 図6 停止コドンコンテキスト解析とデュアルルシフェラーゼアッセイの模式図。
(a) トリパノソーマのタンパク質コード遺伝子の3′末端における終止コドン位置周辺のGC含有量。B. nonstopゲノムのGC分布は、他のトリパノソーマ類と異なり、コード領域内と遺伝子間領域内では劇的に異なっている。前者はGCに富むが、遺伝子の3′末端直後はA+Tに富むゲノム配列になる。(b)停止コドンから100ntまでの配列ロゴ。停止コドンから39ntまではAが最も多く、それ以降はTが多い。帰無仮説としての停止コドン後の最初の40ヌクレオチドにおけるAsとTsの等量性は、両側p値<0.0001で棄却された; χ²1 = 1218.98. (c) デュアルルシフェラーゼアッセイを模式的に示す。ホタルとレニラのルシフェラーゼ遺伝子の間に位置するインフレームUGAコドンからなるカセットを、tRNATrpCCAの4または5bp長の変異体を発現するT. bruceiまたはS. cerevisiaeにエレクトロポレートした。
Extended Data 図7 T. bruceiで発現するtRNATrpCCAバリアントの検出とチャージ。
(a)分析したすべてのtRNATrpバリアントの遺伝子投与量の増加は、in vivoでの細胞レベルを大幅に増加させる。S. cerevisiae、B. nonstop、T. brucei、C. magnum由来の4bp対5bp長tRNATrp（hc tW）変異体（各パネルの上部に記載）をプラスミドに保持したT. brucei株からtotal RNAを抽出した。10μgのRNAを尿素PAGEで分離し、tRNAバリアントに特異的な32P標識オリゴヌクレオチドを用いたノーザンブロット分析を行った；ローディングコントロールとして5.8S rRNAを用いた。(b) 発現したすべての tRNA バリアントは、等しいレベルのアミノアシル化を示す。サンプルは、荷電した tRNA を保護するために酸性条件を適用した以外は、パネル a と同様に調製した。RNAサンプルのアリコートを脱アシル化に供した（「塩基+」とラベル付け）。10μgのアシル化または脱アシル化RNA試料を酸尿素12%ポリアクリルアミドゲルで分離し、ナイロン膜に転写して、所定のtRNAバリアントに特異的な32P標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした；ローディングコントロールとして5.8S rRNAが使用された。アンチコドン茎第5塩基対（26:42）の塩基間の水素結合の性質は、縦の黒線（塩基パーリングあり）または赤丸（パーリングなし）で示されている。3回繰り返して同様の結果を得た。ゲルのソースデータについては補足図1、定量化についてはソースデータ拡張データ図7と9を参照のこと。
ソースデータ
Extended Data 図8 制御ストップコドンのリードスルー解析。
(a-c) 「アンチコドン茎長」効果は、UGAにのみ特異的である。(a) T. brucei細胞を、B. nonstop由来の4bpまたは5bpのASバージョンで空ベクター（EV）またはtRNATrpCCA（tW）を用いて形質転換し、「方法」の記載に従ってUAGまたはAAリードスルー測定の処理を施した。リードスルー値は、コントロール細胞株（インフレームストップを含まないデュアルルシフェラーゼカセットを含む）に対して正規化された。アンチコドン茎第5塩基対（26：42）の塩基間の水素結合の性質は、縦の黒線（塩基パーリング）または赤の十字（パーリングなし）で示される。box-and-whiskerプロットの各ボックスは、n = 9のリードスルー値（n = 3生物学的複製を含む各3つの個別実験）で表されている。平均値は(+)であり、ひげは最小値から最大値までの範囲である。統計的有意性は、対応のない両側Welchのt検定によって決定した；*** p < 0.0001; *** p < 0.001; * p < 0.05; ns =非有意であった。(b〜c）酵母株H541を、EVまたは所定の高コピーtRNATrp変種または対照であるリードスルー誘導酵母tRNATyr（tY）と共に、対応するデュアルルシフェラーゼリードスルーレポーター構築物YEp-R／T-UAGC-L（パネルb）またはYEp-R／T-UAAC-L（パネルc）でトランスフェクトさせた。得られた形質転換体を合成培地で培養し、方法論に記載されているように停止コドンリードスルー測定のために処理し、パネルaのように分析しプロットした；*** p < 0.0001；** p = 0.0002；* p < 0.03；n = 15値（それぞれ5生物的複製を含む3個別実験；ソースデータ図3、4および拡張データ図8中の蛍およびレニラの測定生データも参照のこと）。(d) 「アンチコドン茎長」効果は、アミノ酸飢餓ストレスに依存しない。酵母株ZH252を、EVまたは所定の高コピーtRNATrpバリアントとともに、対応する二重ルシフェラーゼリードスルーレポーター構築物YEp-R/T-UGAC-Lで形質転換させた。得られた形質転換体を合成培地でO.D.が〜1まで成長させ、3-AT（3-アミノ-1，2，4-トリアゾール；最終濃度10mmol／l）で6時間処理するか、しないか（nt）した。その後、両方の培養物を、方法に記載されているように停止コドンリードスルー測定のために処理し、パネルaのように分析しプロットした；n＝10値（5生物学的複製を含む各2個の個々の実験；ソースデータ図3、4および拡張データ図8のホタルおよびレニラの測定の生データも参照）。(e）UGAストップコドンテトラヌクレオチドの性質は、様々な真核生物からの4bp長のアンチコドン幹tRNATrp変異体と5bp長のアンチコドン幹tRNATrp変異体が示す読み取りレベルの差に影響を与えない。酵母株H541を対応するデュアルルシフェラーゼリードスルーレポーター構築物で形質転換した（左から右へ。YEp-R/T-UGAC-L; YEp-R/T-UGAA-L; YEp-R/T-UGAG-L; YEp-R/T-UGAU-L または YEp-R/T-CAAC-L) と EV または所定のハイコピーtRNATrp変異体と共に、酵母H541株を形質転換した。得られた形質転換体を合成培地で増殖させ、方法において記載されているように停止コドンリードスルー測定のために処理し、パネルaにおけるように分析しプロットした；n＝9値（3つの生物学的複製を含む各個別実験；ソースデータ図3、4および拡張データ図8のホタルおよびレニラの測定生データも参照されたい）。(f) S. cerevisiaeのCysおよびArg tRNAのアンチコドン茎を5 bpから4 bpに短縮しても、酵母のUGA-TMVリードスルーレベルには影響がない。酵母H541株を、対応するデュアルルシフェラーゼリードスルーレポーター構築物（YEp-R/T-UGA-TMV-LまたはYEp-R/T-CAAC-L）で、その後EVまたはCysまたはArg tRNA変異体のいずれか所定の高コピーで形質転換させた。得られた形質転換体は、合成培地で成長させ、方法において記載されているように停止コドンリードスルー測定のために処理し、パネルaにおけるように分析しプロットした；n＝12値（それぞれ、3、4および5の生物学的複製を含む、3つの個々の実験；ソースデータ図3、4および拡張データ図8のホタルおよびレニラの測定生データも参照のこと）。(g) 酵母eRF1のsup45S67G置換は、UGAの解読を厳密に制限している。野生型eRF1（sup45Δ＋SUP45）またはS67G eRF1置換（sup45Δ＋sup45S67G）を有する酵母株を、対応するデュアルルシフェラーゼリードスルーレポーター構築物（YEp-R/T-UGAC-L； YEp-R/T-UAAC-L または YEp-R/T-UAG-L ）でトランスフォームさせた。得られた形質転換体を合成培地で増殖させ、方法論に記載されているように停止コドンリードスルー測定のために処理し、パネルaのように分析しプロットした；n＝11値（それぞれ、3、4および4生物学的複製を含む3個の個々の実験、ソースデータ図3、4および拡張データ図8のホタルおよびレニラの測定値の生データも参照）。統計的有意性は、対応のない両側Welchのt検定によって決定された; **** p < 0.0001; *** p < 0.001.
出典データ
Extended Data 図9 本研究でS. cerevisiaeで試験したすべてのtRNAの発現量とチャージ効率。
(a)分析したすべてのtRNATrp変異体の遺伝子投与量を増やすと、生体内の細胞レベルが大幅に上昇する。S. cerevisiae、B. nonstop、T. brucei、またはC. magnum由来の4bp対5bp長のtRNATrp（tW）変異体（各パネルの上部に示す）をプラスミドで高コピーに発現した酵母株H541から全RNA試料を単離した。0.5 または 1 µg の総 RNA を Criterion Precast ゲルで分離し、ナイロン膜に移した後、tRNATrp に対する特定の DIG 標識プローブとハイブリダイズさせた。5.8S rRNAはローディングコントロールとして使用した。(b)すべてのtRNATrp変異体の遺伝子量の増加（4bp対5bp）は、アミノアシル化のレベルが同等であることを示している。トータルRNAサンプルは、荷電したtRNAを保護するために酸性条件を適用した以外は、パネルaと同様に調製した。RNAサンプルのアリコートを脱アシル化に供した（「塩基+」とラベル付け）。0.5 µgのアシル化または脱アシル化RNAサンプルを酸尿素12%ポリアクリルアミドゲルで分解し、ナイロン膜に移し、tRNATrpに対する特定のDIG-標識プローブとハイブリダイズさせた。5.8S rRNAはローディングコントロールとして使用した。アンチコドン茎第5塩基対（26:42）の塩基間の水素結合の性質は、縦の黒線（塩基パーリング）または赤の十字（パーリングなし）で示されている。3回繰り返して同様の結果を得た。ゲルのソースデータについては補足図1、定量化についてはソースデータ拡張データ図7と9を参照のこと。
ソースデータ
Extended Data 図10 様々な生物種由来のeRF1のアラインメント。
非正規の遺伝暗号を持つ種は、グレーの背景で強調されている。配列中のXはフレーム内の停止コドンを表す。青と黄色の枠で囲まれたアラインメント領域は、eRF1が停止コドンを認識するために必要な保存モチーフに対応する。すべてのブラストクリチジア属細菌は、重要な置換Ser70Gly（ヒトの配列に従って番号付け；S. cerevisiaeではSer67またはB. nonstopではGly74）を示す。その他のモチーフは変更されていない。
補足情報
補足情報
このファイルには、補足説明、分類学的概要、方法、表1-4、参考文献が含まれています。
報告書の概要
補足情報2
精製したB. nonstop tRNATrpCCAのMSによる全ヌクレオシド分析結果を含むSupplement スプレッドシート。
補足図1
Fig.2-4、Extended Data Fig.7、9のノンクロップドゲルのソースデータ。
補足データ1
B. nonstopの70のtRNA遺伝子の配列を含むFastaファイル。
補足データ2
B. nonstopと関連トリパノソーマのtRNAGluの完全系統樹を含むFasta.treeファイル。
査読ファイル
補足動画1
Blastocrithidia nonstopのUGA再割り当て。UGA停止コドンがリボソームAサイトに入ると、正規の遺伝暗号を持つすべての生物の真核生物解放因子1（eRF1）がそれを認識し、翻訳を終了させる。トリプトファニルtRNA（Trp-tRNATrp）は、UGAに近い（3番目の塩基が揺らいでいる）tRNAであるが、その認識は非常に非効率的である。しかし、新たに単離されたトリパノソーマのB. nonstopは、3つの停止コドンをすべてセンスコドンに置き換えることで、UGAをトリプトファンとして非常に効果的に読み取ることができ、翻訳の継続を可能にする2つの変異を蓄積している。すなわち、tRNATrpアンチコドン幹を5塩基対から4塩基対に短縮し、UGAが占めるAサイトへのTrp-tRNATrpの収容を大幅に向上させたことと、eRF1のストップコドン認識モチーフにSer74Glyを置換し、UGA認識を大きく制限したことである。
ソースデータ
ソースデータ 図3、図4、拡張データ 図8
ソースデータ Extended Data Fig.
ソースデータ 拡張データ Fig.
ソースデータ 拡張データ 図7と図9
権利と許可
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Kachale, A., Pavlíková, Z., Nenarokova, A. et al. Short tRNA anticodon stem and mutant eRF1 allow stop codon reassignment（短いtRNAアンチコドンステムと変異型eRF1が停止コドンの再割り当てを可能にする）. ネイチャー (2023)。https://doi.org/10.1038/s41586-022-05584-2
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受領日
2022年1月14日
受理済
2022年11月18日
公開日
2023年1月11日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05584-2
研究テーマ
寄生虫の進化
tRNA
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