ランダム変異誘発マウスにおける睡眠の前方遺伝学的解析

睡眠は無脊椎動物から脊椎動物まで保存されており、ホメオスタシス的に緊密に制御されている。急速眼球運動睡眠（REMS）と非REMS（NREMS）の量を決定する分子・細胞機構は未だ不明である。ここでは、無作為に突然変異させたマウスの脳波/筋電図ベースのスクリーンを用いて、睡眠と覚醒に影響を与える2つの優性変異を同定した。Sik3プロテインキナーゼ遺伝子のスプライシング変異は、先天的な睡眠必要量の増加により、総覚醒時間の大幅な減少を引き起こす。睡眠不足はキナーゼ上の調節部位のリン酸化に影響を与え、睡眠量の恒常性調節におけるSIK3の役割を示唆している。SIK3のオルソログもまた、ミミズバエやラウンドワームの睡眠を制御している。ナトリウムリークチャネルであるNALCNの機能獲得型のミスセンス変異は、REMSを抑制するニューロンの興奮性を高めることで、明らかにREMSの総量とエピソードの持続時間を減少させる。この結果は、マウスの睡眠行動を研究するためのフォワード遺伝学的アプローチの有用性を実証するものであり、NREMSとREMSの量を制御する上で、SIK3とNALCNがそれぞれ役割を果たしていることを示している。

睡眠は、脊椎動物からハエや線虫1-3を含む無脊椎動物まで普遍的に保存されている動物の行動であり、密接に恒常性の方法で制御されています。哺乳類の睡眠は、脳波（EEG）と筋電図（EMG）の特徴的な活動によって定義されるREMSとNREMSのサイクルを示す。睡眠中の時間は、恒常的な睡眠必要性、覚醒時に増加し、睡眠中に消散する睡眠/覚醒の切り替えのための原動力によって決定されます4,5。NREMS時の脳波のデルタレンジ周波数（1-4 Hz）のスペクトルパワーは、睡眠必要性の現在のレベルのための最良のマーカーの一つとみなされている。逆に、覚醒のレベルは、全体的な活動を反映して、睡眠の必要性6とは独立して制御することができる睡眠潜時と正の相関がある
覚醒を促進するニューロンの 睡眠と覚醒行動を制御する神経回路を見つけるための伝統的なアプローチは、脳領域の局所的なアブレーション7-9が含まれています。視能遺伝学的・化学遺伝学的研究の最近の進歩は、睡眠状態と覚醒状態の切り替えが前脳基底部10、側方視床下部11,12、および脊髄座13のニューロンのサブセットによって実行され、NREMSとREMSの切り替えがポンズと髄質14,15の神経ネットワークによって実行されることを直接的に示している。蓄積しているにもかかわらず
睡眠状態と覚醒状態を制御する実行神経回路に関する情報はあっても、覚醒状態、REMS、NREMSの切り替えの傾向を決定する分子・細胞メカニズムは不明のままである。この問題に取り組むために、私たちは、特定の働きをしない表現型駆動型の前方遺伝学的アプローチを用いています。
という仮説を立てた16。以前、ハエを用いた一連の前方遺伝学的研究
とマウスを用いて、概日行動を調節するコアクロック遺伝子の分子ネットワークを明らかにすることに成功した17-19。また、変異原性ハエのスクリーニングにより睡眠調節遺伝子も発見されている1,2。しかし、マウスを用いた睡眠の遺伝子研究は、睡眠と覚醒の調節に効果的な補償と冗長性があり、覚醒、NREMS、REMSのステージングの脳波と筋電図のモニタリングが必要であるため、困難を極めていた。

Sik3スプライス変異はNREMSを増加させる エチルニトロソウレア（ENU）を用いてC57BL/6J（B6J）雄性マウス（G0）にランダム点突然変異を誘導し、8,000匹以上のスクリーニングを行った。
ヘテロ接合体B6J×C57BL/6N（B6N）F1マウスを用いて、脳波/脳波に基づく睡眠ステージングによる優性睡眠・覚醒異常を調べた（拡張データ図1a）。B6Nは、その睡眠・覚醒パラメータがB6Jと非常に類似しており（拡張データ図1b）、一塩基多型の全リストが最近利用可能になったことから、対抗系統として選択された20。我々のスクリーニングを通して、我々は著しく延長された睡眠時間を持つ、我々はスリーピー（Slp）と呼んでいる変異体の血統を確立した。スリーピー突然変異血統の5つの祖先は、同じENU処理G0オスからの精子を使用して体外受精によって生まれ、> 3標準偏差（拡張データ図1c）でスクリーニングしたすべてのマウスの平均よりも短かった1日の覚醒時間（524±19.7分、平均± s.d.）を示した。スリーピー血統は、低下した覚醒時間の明らかな優性遺伝を示した（図１ａ）。5匹のSleepy血統（B021-B025）のB6J×B6N N2世代の連鎖解析は、9番染色体上に、rs13480122（chr9：31156626）とrs29644859（chr9：52785119）の間の単一の対数オッズ比（LOD）スコアのピークをもたらした（図1bおよび拡張データ図2a）（図1b、c）。Sleepy変異体の全ゲノムシークエンシングにより、Sik3遺伝子のイントロン13のスプライスドナー部位（chr9: 46198712）にヘテロ接合性の1ヌクレオチド置換が確認された（図1d、e）。この突然変異は、エクソン13の異常なスキップ（Sik3Slp/+）を予測しており、これは逆転写PCRによって確認された。
RT-PCR）およびSik3 mRNAの配列決定（図1f、補足図1および拡張データ図2b）を行った。
SIK3は、大脳皮質、視床、視床下部、脳幹の神経細胞に広く発現するプロテインキナーゼであり（拡張データ図2c、d）、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）ファミリーに属しています。SIK3は、N末端にセリン-スレオニンキナーゼドメイン、中間部にプロテインキナーゼA（PKA）認識部位（Ser551）を有する。
部分21（図1g）。エクソン13のスキップは、52アミノ酸のインフレーム欠失をもたらし、PKAサイトを包含する（図1g.
拡張データ図２ｅおよび補足図１）。) 抗ＳＩＫ３抗体を用いたＳＩＫ３Ｓｌｐ／＋マウスおよびＳＩＫ３Ｓｌｐ／Ｓｌｐマウスからの脳ホモジネートのイムノブロットは、予測通りのより小さいＳＩＫ３タンパク質を検出した（図１ｇ、ｈおよび補足図１）。この突然変異の性質は、ショウジョウバエメラノガスターにおけるSIK3オルソログに関する我々の結果と一緒に考慮される

およびCaenorhabditis elegans（後述）は、Sik3Slpが
機能獲得対立遺伝子を導入した。Sik3スプライス変異が長眠表現型の唯一の原因であることを遺伝的に確認するために、胚性幹（ES）細胞における従来のノックインまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）技術のいずれかを用いて、Sik3エクソン13スキップ対立遺伝子を野生型マウスに導入した（図1i、拡張データ図3bおよび補足図1）。予想されるように、これらのマウス系統は、元のSleepy血統と同様に、顕著に減少した覚醒時間を示した（図１ｊ、拡張データ図３ｃ）。このように、Sik3遺伝子のエクソン13の欠失がSleepy表現型を引き起こす。

図1｜総覚醒時間の短縮に関与するSik3スプライシング変異の同定 a, B023 N2期末期マウスの覚醒時間分布（棒）とスクリーニングした全マウスの覚醒時間分布（曲線）。青と紫のバーは、それぞれレトロスペクティブジェノタイピングされたSik3+/+マウスとSik3Slp/+マウスを示す。 b、全覚醒時間に関するB023血統（n = 93）の定量的形質座（QTL）分析。インセットは、rs13480122とrs29644859の間のLODスコアピークを示しています。 c、スリーピー表現型の存在の観点から、スリーピー変異体血統、B021-B025のハプロタイプ分析。
f, Sik3 mRNAのRT-PCRにより、Sik3Slpマウスに特異的な小さなバンドが得られた。g, 野生型および変異型SIK3タンパク質の構造 h, 野生型(+ /+ )および変異型SIK3 (Slp/+およびSlp/Slp)タンパク質バリアントを示す脳ホモジネートの免疫ブロッティング。j、Sik3Slp(ZFN)/+マウス（n = 15）は、野生型の実験動物（n = 14）よりも短い総覚醒時間を示した。* * * * P < 0.001、双方向分散分析（ANOVA）に続いてTukeyの検定を行った。データは平均値± s.e.m.。

Sleepy突然変異体における睡眠必要性の増加 Sleepy突然変異体では、睡眠時の脳波/EMGに明らかな異常は見られなかった（拡張データ図4a）。Sleepy変異体の睡眠・覚醒行動を詳細に調べたところ、Sik3Slp/+マウスは明期と暗期の両方で覚醒時間の減少とNREMS時間の増加を示したが、過眠症の表現型は暗期でより顕著であることが示された（図2a,b）。
の効果を示した。ホモ接合のSik3Slp/Slpマウスは、Sik3Slp/+マウスと比較して、総覚醒時間がさらに短く、NREMS時間が長かった（図2a、bおよび拡張データ図4b-d）、これは対立遺伝子用量効果を示している。全REMS時間は遺伝子型群間で類似していた（拡張データ図4e）。Sik3Slp/+マウスおよびSik3Slp/Slpマウスは、より高いNREMS/総睡眠時間比（拡張データ図4f）およびより低いREMS/総睡眠時間比（拡張データ図4g）を有しており、Sleepy変異マウスにおけるNREMS特異的な変化を示していた。暗期のREMSに費やす時間が長くなるのは、睡眠量の増加に伴って二次的なものと考えられ、明期のREMS時間が短くなることで補われていると考えられる（拡張データ図4h）。雌のSik3Slp/+マウスおよびSik3Slp/Slpマウスも同様の表現型を示した（拡張データ図4i）。次に、Sleepyマウスの短い覚醒時間が、行動的刺激または薬理学的刺激に対する覚醒促進応答の欠陥によるものであるかどうかを調べた。新しいケージ環境はマウスの覚醒促進系を強く動員する6。Sik3Slp/+とSik3Slp/Slpの両方
Sik3Slp/+およびSik3Slp/Slpマウスは、明期（図2c）および暗期（拡張データ図5a）において、野生型の実験動物と同様に、ケージ変化に対する顕著な覚醒反応を示した。Sik3Slp/+およびSik3Slp/Slpマウスはまた、カフェインの投与に応答して覚醒時間の増加を示した。
図２ｄ）またはモダフィニル（拡張データ図５ｂ）を用いて、Ｓｉｋ３＋／＋個体と同様の、またはわずかに高い程度にまで、Ｓｉｋ３＋／＋個体と同様の、またはわずかに高い程度にまで変化させることができた。次に、Sleepy変異体の行動的概日リズムを調べた。一定の暗闇下での輪走行動によって評価される概日リズムの長さは、遺伝子型グループ間で類似していた（拡張データ図５ｃ）。スリーピー突然変異体マウスは、一定の暗闇下でも明暗条件と同様に、覚醒時間の頑健な減少を示した（拡張データ図５ｄ）。
覚醒促進系とサーカディアン系が一見正常であることを考えると、Sleepy変異体は本質的に高い睡眠必要度を持っているのではないかと提案した。実際、Sleepy突然変異マウスでは、NREMS時の遅波活動の密度が、対立遺伝子のドサージュに依存して高くなっていた（図2e）。脳波の低周波パワーは、スリーピー変異体マウスの覚醒時にも増加した（拡張データ図5e）、これは、睡眠必要性の増加に起因する局所的な皮質同期と関連している可能性があります22。さらに、光相の開始から6時間の睡眠遮断を行うと、Sik3SlpマウスのNREMSデルタパワーはSik3+/+マウスよりも大きな範囲で増加した（図2f）。次に、用量依存的な効果を調べるために、2時間、4時間、6時間の睡眠遮断を行った。我々の条件では、Sik3+/+マウスは2時間の睡眠遮断後にわずかな増加しか示さなかったのに対し、Sik3Slp/+マウスはデルタパワーの顕著な用量依存的増加を示し（図2gおよび拡張データ図5f）、睡眠遮断に対する大げさな応答を実証した。SIK3が恒常的な睡眠必要度のレベルを決定する謎の分子経路の一部を構成するならば、タンパク質は、睡眠遮断によって調節されるはずです。SIK3の機能はそれ自身のリン酸化23によって制御されているので、我々はCRISPR/Cas9技術を使用してSIK3のN末端にフラグタグを挿入したマウスから脳内でのそのリン酸化の状態を調べた（拡張データ図6a）。抗SIK3抗体および抗Flag抗体を用いたイムノブロットおよび免疫沈降により、予想通り脳内のFlag-SIK3タンパク質が検出された（拡張データ図6b-dおよび補足図1）。睡眠遮断がＳＩＫ３のリン酸化状態に影響を与えるかどうかを調べるために、睡眠遮断後にＦｌａｇｇ-ＳＩＫ３マウスの脳を得た。免疫精製したFlagtagタンパク質の定量的リン酸化プロテオーム解析の結果、睡眠遮断はSIK3のキナーゼ活性と密接に関連する残基Thr221のリン酸化を特異的に増加させることが示された（参考文献23；図2h）。同様にして、Sik3Slp対立遺伝子にFlag配列を導入し、変異Flag-SIK3(SLP)タンパク質を発現するマウスを得た（拡張データ図6b、c
および補足図１）。) 脳内のFlag-SIK3(SLP)は、予想されたSer551のリン酸化の減少に加えて、光期の間のアドリバイタム睡眠下でFlag-SIK3マウスと比較して、別のPKAサイト24であるThr469のリン酸化の減少、およびSer914のリン酸化の増加を示した（拡張データ図5g）。睡眠遮断後、これらのリン酸化変化は持続し、別のPKA部位24であるSer674のリン酸化の有意な増加が認められた（拡張データ図5g）。このように、Ser551を含む領域の欠如は、複雑な方法で他のPKA部位のリン酸化状態を乱し、Sleepy変異マウスの睡眠必要性の増加との機序的な関連を示唆している。

図2｜Sik3変異マウスの睡眠必要量の増加と正常な覚醒促進反応。a, b, Sik3+/+マウス（n = 22）、Sik3Slp/+マウス（n = 32）、およびSik3Slp/Slpマウス（n = 31）における覚醒度（a）とNREMS（b）の概日変化。* c、Sik3+/+ (n = 6)、Sik3Slp/+ (n = 9)およびSik3Slp/Slp (n = 6)マウスのZT5でケージを変更した後、zeitgeber時間 (ZT)4からZT5までの覚醒状態で過ごした時間。* d、Sik3+/+（n = 6）、Sik3Slp/+（n = 6）およびSik3Slp/Slp（n = 6）マウスのZT0でカフェイン注入後6時間の覚醒時間。* e、明暗サイクルにおけるSik3変異マウス（Sik3+/+、n = 22; Sik3Slp/+、n = 32; Sik3Slp/Slp、n = 31）のNREMSデルタ密度。* f、6時間睡眠遮断後のSik3+/+（n = 7）、Sik3Slp/+（n = 7）およびSik3Slp/Slp（n = 10）マウスのNREMSデルタパワーの増加。 * g、Sik3+/+（n = 11）およびSik3Slp/+（n = 11）マウスの2、4および6時間の睡眠遮断後のNREMSデルタパワーの増加は、基底睡眠中に同じZTのNREMSデルタパワーと比較して。p < 0.05; * * * p < 0.01; * * * p < 0.001、双方向ANOVA、その後のTukeyの検定。 h、4時間睡眠遮断の有無にかかわらず、FlagSik3+/+の脳のFlag-SIK3のリン酸化。* P < 0.05、双方向ANOVAに続いてTukeyの検定を行った。データは平均± s.e.m.。

無脊椎動物におけるSIK3の保存された役割 Sik3のエクソン13-エンコード領域は、脊椎動物の間で高度に保存されている（図3a）。特に、エクソン13-エンコード領域内にはPKA認識部位があり、ショウジョウバエや線虫のSik3オルソログでも保存されています（図3a、拡張データ図7）。
ショウジョウバエの睡眠様行動におけるSik3オルソログの役割を調べるために、リン酸化欠損型Sik3（Ser563Ala；マウスSik3のSer551に相当するセリン残基）をRU486誘導性で神経細胞に発現させた。成虫ハエの一日の睡眠時間は、SIK3(Ser563Ala)の誘導後に増加する（図3b、c）。逆に、低型Sik3変異を持つハエでは、明暗サイクルおよび一定の暗闇下での睡眠時間の減少が見られた（図3d）。さらに、Sik3の正体であるkin-29のヌル変異は、C.elegans3の睡眠に似た状態であるL4-adult lethargusの間の静止の割合を減少させた（図3e）。この表現型は、Kin-29のパンニューロン発現によって救われた。このように、Sik3のオルソログは、ミミズバエや線虫の睡眠量の調節にも関与していると考えられる。

図4｜Nalcn遺伝子のミセンス変異はREMS時間とエピソード持続時間を短縮する。 a、スクリーニングしたG1マウスのREMSエピソード持続時間のヒストグラム（平均±s.d.=1.41±0.19分）。矢印はドリームレス変異体血統の創始者を示す。 b、ドリームレス変異体血統（n = 56）のREMSエピソード持続時間に関するQTL解析。c, Nalcn遺伝子の直接シークエンス。 d, e, Dreamless変異体血統のNalcnDrl/+マウス（n = 29）とNalcn+/+マウス（n = 25）の総REMS時間（d）とREMSエピソード持続時間（e）。f、g、CRISPR/Cas9技術を用いて作製したNalcnDrl/+マウス（n = 11）とNalcn+/+マウス（n = 17）の総REMS時間（f）とREMSエピソード持続時間（g）。 * * * * P < 0.001、両側スチューデントのt検定。データは平均± s.e.m.。

Nalcnの変異はREMSを減少させる ENU変異マウスの脳波・脳波・脳電図を用いた優性スクリーニングでは、REMSの異常を持つ突然変異血統が得られた。この血統の創始者は、REMSエピソードの持続時間が短く（図4a）、子孫に遺伝性があることを示した（拡張データ図8a）。B6J×B6N N2世代の連鎖解析では、14番染色体上のrs31233932（chr14: 124108797）付近にLODスコアのピークが見られました（図4b、拡張データ図8b）。全ゲノムシークエンシングと候補遺伝子の直接シークエンシングを組み合わせた結果、Nalcn遺伝子（chr14: 123515403）のヘテロ接合性ミスセンス変異が、Dreamless変異体のマップされた領域内で唯一機能的に関連する変異であることが確認されました（図4c、拡張データ図8c）。次に、CRISPR/Cas9システムを用いて野生型マウスに同じヌクレオチド置換を導入することにより、Nalcn遺伝子変異とREMS表現型との因果関係を確認した。CRISPR NalcnDrl/+マウスでは、ドリームレスマウスと同様に短いREMSエピソード持続時間を示した（図4d-g）。
Dreamlessマウスでは、REMS時にシータ（6-9Hz）優位の脳波と適切な筋萎縮を示したが、脳波・筋電図には明らかな異常は認められなかった（拡張データ図9a）。NalcnDrl/+マウスでは、平均的なREMSエピソード持続時間が短いため、REMS時間が短縮された（図4d-g、拡張データ図9b,c）。つまり、NalcnDrl/+マウスはREMS状態を適切に維持することができず、非常に不安定なREMS状態となっていたのです。NalcnDrl/+マウスの覚醒状態とNREMS状態の合計時間は、Nalcn+/+マウスと同様であった（拡張データ図9d）。NalcnDrl/+マウスは正常なサーカディアン期間の長さを持っていたが、一定の暗闇下では行動的サーカディアンリズムの振幅が大幅に減少していた（拡張データ図9e、f）。
このことは、最近報告された視交叉上核における神経細胞の興奮性のサーカディアン制御に NALCN が関与していることと一致している25。NalcnDrl/+マウスでは、一定の暗闇下でもREMS時間の顕著な減少が観察された（拡張データ図9g）。脳波のスペクトル解析では、NalcnDrl/+マウスではNREMSとREMS時のシータ域のパワーが減少し、覚醒状態とREMS時の低周波パワーが増加していることが示された（拡張データ図9h）。
NALCNは、神経細胞の興奮性の制御に提案された役割を持つ電圧非依存性、非選択的なカチオンチャネルである26。NALCNは、REMSの制御に関与するいくつかの脳幹核で高度に発現しており、例えば、前頭葉周囲灰色、深部中脳核（DpMe）、側方背側下核7,9,14,15などで発現している（拡張データ図10a-c）。この突然変異は、脊椎動物や無脊椎動物に保存されているドメインIのヘリックスS6にAsn315Lysの置換をもたらします（図5a）（図5b）。この突然変異が NALCN の電気生理学的特性を変化させるかどうかを調べるために、我々は NALCN または NALCN(DRL) 変異体を UNC80 と SRC(Tyr529Phe)とともにコトランスフェクションした HEK293 細胞を用いてパッチクランプ記録を行った27,28。NALCNとNALCN(DRL)は、どちらも直線的な電流-電圧関係を示した（図５ｃ、ｄおよび拡張データ図１０ｄ、ｅ）。
NALCN(DRL), -2.1 ± 1.6 mV, n = 7; NALCN(DRL), -1.2 ± 0.7 mV, n = 5, P = 0.94, Mann-Whitney U 検定）のイオンコンダクタンスはNALCNの方がはるかに大きかった（図5e）。しかし、NALCN(DRL)のイオンコンダクタンスは、NALCNよりもはるかに大きかった（図5e）。同様に、NALCN(DRL)を導入した細胞では、内向き電流と外向き電流の電荷移動が、NALCNを導入した細胞よりも著しく高かった（拡張データ図10f）ことから、NALCN(DRL)がREMS制御ニューロンの本来の興奮性を高める可能性が示唆された。この可能性を検証するために、NalcnDrl/+マウスとNalcn+/+マウスの脳スライスを用いて、「REM-off」細胞15,29,30を含むDpMe（拡張データ図10a）のニューロンから全細胞電流クランプ記録を行った。NalcnDrl/+のスライスのDpMeニューロンは、脱分極（Nalcn+/+、-65.6 ± 1.7 mV、n = 33細胞、NalcnDrl/+、-57.8 ± 2.0 mV、n = 31細胞、P = 0.01、マンホイットニーU検定）と高い自発発火率（Nalcn+/+、0.4 ± 2.3スパイクスパイク）を示した。 4±2.3スパイクs-1、n = 33細胞、NalcnDrl/+、2.3±0.8スパイクs-1、n = 31細胞、P = 0.03、Mann-ホイットニーU検定）とNalcn+/+スライス（図5f-h）と比較して高い自発発火率（Nalcn+/+、0.3±2.3スパイクs-1、n = 33細胞、NalcnDrl/+、2.3±0.8スパイクs-1、n = 31細胞、P = 0.03、Mann-ホイットニーU検定）を示した。

図5 Nalcn遺伝子に夢のない突然変異があると、レムオフ領域のニューロンの興奮性が高まる。 c, 野生型NALCN（上）または変異型NALCN（DRL）（中）をトランスフェクトしたHEK293T細胞から記録された-80mVから＋80mVまでの300-msステップパルス（保持電位Vh = 0mV、下）に応答する膜電流の代表的なトレース。 d, 野生型 NALCN（n = 5、黒丸、右下）または NALCN(DRL)（n = 7、紫丸）の平均電流-電圧（I-V）曲線。 e、NALCN(DRL)をトランスフェクトした細胞のコンダクタンスは、野生型NALCNをトランスフェクトした細胞のコンダクタンスよりも大きかった（NALCN、0.09±0.02 nS pF-1、n = 5；NALCN(DRL)、1.81±0.62 nS pF-1、n = 7）。* Nalcn+/+マウス（上）とNalcnDrl/+マウス（下）のDpMeニューロンの膜電位の代表的なトレース。g, h, DpMeニューロンの平均膜電位(g)と自発発火率(h) (Nalcn+/+, n = 33; NalcnDrl/+, n = 31)。 * P < 0.05、Mann-Whitney U 検定。データは平均値± s.e.m.

Discussion マウスにおける私たちの脳波/EMGベースのフォワード遺伝学的スクリーンは、明確な睡眠表現型と変異遺伝子を同定した。しかし、我々の研究はまた、脊椎動物や無脊椎動物の睡眠行動におけるSIK3の保存された役割を示している。我々は、SIK3のSleepy変異が
なぜなら、Sleepy変異マウスは、(1)ホメオスタティックな睡眠必要性の信頼できる指標である遅波活動の密度が高く、(2)睡眠遮断後のNREMSデルタパワーの増加が大きく、(3)行動的または薬理学的覚醒刺激に対する正常な覚醒反応を示すからである。さらに、SIK3の機能的に関連するリン酸化状態は、睡眠遮断によって調節され、それによって睡眠必要性の急性増加が誘導されることを発見した。さらに、Sleepy突然変異はアレル用量依存的にベースラインのNREMS量を著しく増加させることがわかったことから、我々は、SIK3が睡眠必要性を決定する細胞内シグナル伝達経路で機能し、1日の睡眠量を恒常的に調節していることを提案する。我々は、NALCNがREMSエピソードの維持と終了のためのREMS9,14,15を制御する神経細胞群で働くことを提案する。NALCNのショウジョウバエオルソログの機能喪失変異を持つ狭腹部変異体は、麻酔31と異常な概日行動32に対する感受性の増加を示している。覚醒状態と麻酔状態、および覚醒状態と睡眠状態の間の双安定性を高める狭腹部の重要な役割33は、ドリームレス変異マウスの非安定化されたREMSエピソードと一致している。このように、上記のSIK3の場合と同様に、NALCNオルソログもまた、マウスとミミズバエの両方で睡眠に関連した行動を制御する上で、概念的に類似した役割を持っているように思われる。我々の結果は、哺乳類の睡眠を制御する遺伝子、対立遺伝子、経路の発見のために、偏りのないフォワードジェネティックスクリーンが有用であることを示している。証明に注を追加しました。を記述した関連レビュー記事。
睡眠状態と覚醒状態を制御する神経回路は、参考文献３４に記載されています。34.

リサーチアーティクル
拡張データ 図１ 無作為に変異原化したマウスの睡眠/覚醒度スクリーニング a, ENU処理したG0マウスをB6Nメスと交配して子孫を得た。睡眠／覚醒度分析にはF1マウスを用いた。睡眠異常を示すマウスをB6N雌マウスと交配した。ｂ、Ｂ６Ｊ（ｎ＝２０）およびＢ６Ｎ（ｎ＝２１）は、総覚醒時間（左、Ｐ＝0.67、両側スチューデントのｔ検定）、ＮＲＥＭＳ時間（中央、Ｐ＝0.66）およびＲＥＭＳ時間（右、Ｐ＝0.84）が類似していることを示した。データは平均± s.e.m. c, ヒストグラムは、スクリーニングしたすべてのマウスの1日の総覚醒時間を示す。スクリーンしたマウスの総覚醒時間は735±66.9分（平均±s.d.）であった。矢印は、Sleepy変異体血統の創始者を示す。

拡張データ 図2｜スリーピー変異体血統のQTL解析とSik3転写物の特性評価。 a、総覚醒時間のB021（n = 119）、B022（n = 95）、B024（n = 59）とB025（n = 112）血統のQTL解析は、染色体9上の単一のLODスコアピークをもたらした。Sik3変異マウスに特異的な短いRT-PCR産物の直接配列決定は、エクソン12からエクソン14への直接的な遷移を示している。Sik3 mRNAは一次運動野の大脳皮質全体に発現している（d）。DGは歯状回、LVは側脳室、MHbは内側手綱核。e、Sik3+/+、Sik3Slp/+およびSik3Slp/Slpマウスの大脳皮質および肝臓からのSik3 mRNAのRT-PCR。大脳皮質で発現しているエクソン15を欠く正常なSik3変異体。

拡張データ 図3 Sik3Slpノックインマウスの睡眠・覚醒度。マウスホスホグリセロールキナーゼプロモーター(neo)下のネオマイシン耐性遺伝子をフリッパーゼ認識ターゲット(FRT)配列で挟んだ。イントロン１３の先頭から５番目のヌクレオチドのグアニンをアデニンで置換した。c, Sik3Slp/+ノックインマウス(n = 10)とSik3+/+リターメイト(n = 6)の全覚醒時間。* * * * P < 0.001、双方向ANOVAに続いてTukeyの検定を行った。データは平均± s.e.m.である。

拡張データ 図 4｜Sik3 変異マウスの睡眠/覚醒行動。 a, Sik3 変異マウスの覚醒、NREMS、REMS の代表的な 8 秒間脳波と筋電図。c-g、Sik3+/+（n = 22）、Sik3Slp/+（n = 32）およびSik3Slp/Slpの総覚醒時間（c）、NREMS時間（d）、REMS時間（e）、NREMS/総睡眠比（f）、REMS/総睡眠比（g）およびREMSの概日変化（h）。
(n = 31)マウス。P < 0.05; * * * P < 0.01; * * * * P < 0.001、双方向反復測定ANOVAに続いてTukeyの検定（c-g）。* P < 0.05（赤）; * P < 0.001（黒）、双方向反復測定ANOVAに続いて、Tukeyの検定（h）。* * * P < 0.001、双方向ANOVAに続いてTukeyの検定。データは平均± s.e.m.

拡張データ 図5｜Sik3変異マウスの睡眠/覚醒行動の特徴。 a, Sik3+/+（n = 5）、Sik3Slp/+（n = 10）、およびSik3Slp/Slp（n = 5）マウスのZT15でのケージ変更後の覚醒時間。グラフは、基底状態でのZT15からZT16までの覚醒時の滞在時間と、ZT15で家のケージから新しいケージにケージチェンジした後の時間を示す。P < 0.05; * * * * P < 0.001 対 Sik3+/+; #P < 0.05; ###P < 0.001, 一方向反復測定ANOVA後、Tukeyの検定を行った。* P < 0.05; 同じ遺伝子型の対モダフィニル10mg kg-1、#P < 0.05、##P < 0.01、ツーキーの検定を経て、双方向ANOVA。P = 0.97,
d、一定の暗闇下でのSik3+/+ (n = 9)とSik3Slp/+ (n = 12)マウスの総覚醒時間。* e、Sik3+/+（n = 22）、Sik3Slp/+（n = 32）とSik3Slp/Slp（n = 31）マウスの脳波パワースペクトル。* f、Sik3+/+（n = 11）およびSik3Slp/+（n = 11）マウスの睡眠遮断の2時間後、4時間後および6時間後のNREMSデルタパワーの増加と基底睡眠中の平均NREMSデルタパワーとの相対的な比較。* g、4時間睡眠遮断の有無にかかわらず、Flag-Sik3+/+脳のFlag-SIK3とFlag-Sik3Slp/+脳のFlag-SIK3(SLP)のリン酸化。P < 0.05; * * * * P < 0.001、双方向ANOVAに続くTukeyの検定。データは平均± s.e.m.である。

拡張データ 図６｜CRISPR/Cas9技術を用いて作製されたFlag-Sik3マウスの特性評価 a, Sik3遺伝子のエクソン１は第１および第２のメチオニン残基を含む。シングルガイドRNAは、第2のメチオニンコード領域を標的とするように設計された。ドナーオリゴヌクレオチドは、第２のメチオニンの直後にFlag-haemagglutinin（HA）-コーディング配列を有し、５′および３′の両末端に７０ヌクレオチドのロングアームを有する。Flag-HA-コーディング領域は、XbaI部位に続いている。 b, Sik3+/+, Sik3Flag/Flag Sik3Flag,Slp/+マウスの脳ホモジネートのイムノブロットは、以下のことを示した。
抗Flag抗体はSik3Flag/Flag脳のFlag-SIK3タンパク質とSik3Flag,Slp/+脳のFlag-SIK3(SLP)タンパク質を検出したが、抗SIK3抗体はすべての遺伝子型のSIK3タンパク質を検出した。c, Sik3+/+, Sik3Flag/Flag,Sik3Flag,Slp/+マウスの脳内Sik3 mRNAのRT-PCR。 d, 免疫沈降およびゲル精製されたFlag-SIK3タンパク質のトリプティックペプチドをLC-MSで分析し、リファレンスSIK3タンパク質にマッピングした。ペプチドフラグメントは、高い信頼性でほぼ全体のSIK3タンパク質上にマッピングされた。

拡張データ 図7｜SIK3タンパク質の系統的保存性

図８ 拡張データ 図８｜ドリームレス突然変異血統のNalcn変異の同定 a,ドリームレス突然変異血統のN2期末期マウスのREMSエピソード持続時間のヒストグラム（棒）と全F1マウスのREMSエピソード持続時間のヒストグラム（曲線）。REMSエピソード持続時間が短いマウスはすべてNalcn遺伝子のエクソン9に1ヌクレオチド置換を有していた。

図９ 拡張データ 図９｜Nalcn 変異マウスの睡眠・覚醒行動 a, Nalcn 変異マウスの覚醒、NREMS、REMS の８秒脳波と筋電図 b, Nalcn+/+ マウス（上）と NalcnDrl/+ マウス（下）のヒプノグラム。c, ZT7付近のヒプノグラムを拡大したところ、NalcnDrl/+マウスではNREMSとREMSの間で頻繁に遷移していることがわかった。Wake、P = 0.58; NREMS、P = 0.17。
e, f, NalcnDrl/+マウス(n = 6)とNalcn+/+マウス(n = 7)の暗闇でのサーカディアン期間の長さ(e)とサーカディアン行動の振幅(f)。P = 0.76 (e); * * * * P < 0.001 (f), 両側ステューデントのt検定。 g, NalcnDrl/+マウス(n = 9)とNalcn+/+マウス(n = 8)の恒常暗闇における総REMS時間。* h, NalcnDrl/+マウス（n = 29）とNalcn+/+マウス（n = 25）の脳波パワースペクトル。* * * * P < 0.001、片道ANOVAに続いてTukeyの検定を行った。データは平均± s.e.m.である。

拡張データ 図10｜NALCN(DRL)のコンダクタンスが増加している。 a-c, Nalcn mRNAは、上側海綿体（a）の海綿体周囲灰白質（vlPAG）と深層中脳核（DpMe）、下側海綿体（b）の側方背側区分核（LDT）と側方背側下核（SLD）、髄質（c）の側方傍柄細胞核（LPGi）で発現している。AQ、水管、dscp、上小脳台頭の脱臼、IO、下オリーブ、scp、上小脳台頭。スケールバー、500μm。 d、ランプパルスに応答して膜電流の代表的なトレース（Vh = 0 mV、- 100 mVから+ 100 mVに
UNC80、SRC(Tyr529Phe)、およびNALCN-GFP(上)またはNALCN(DRL)-GFP(中)を共トランスフェクトしたHEK293T細胞から記録された(1秒、下)。このトレースは、3回の試行から平均化したものです。e、ランプパルスに応答した平均電流密度（NALCN、n = 5、黒線；NALCN(DRL)、n = 7、紫線）。f, NALCN(DRL)を導入した細胞の電荷移動は、NALCN(WT)を導入した細胞の電荷移動よりも大きかった。* P < 0.01、Mann-Whitney U 検定。データは平均値±s.e.m.である。