EM菌の正体（構成微生物を調べました）

　EM菌は、元々農業用の微生物資材として堆肥作りを目的として開発されましたが、「農業、環境、健康、食品加工、化学合成、工業、エネルギー、土木建築など広範囲で応用可能であり、従来の微生物関連資材の常識をはるかに超えたものである」としてあたかも万能であるかの様に宣伝されるようになりました。しかし、そのほとんどは科学的根拠に乏しく「ニセ科学」だと批判されています。
参考：疑似科学とされるものの科学性評定サイト（明治大学科学コミュニケーション研究所）
http://www.sciencecomlabo.jp/health_goods/effective_microorganisms.html

　これまではEM菌を構成する微生物が大まかにしか明かされておらず、「特殊な善玉菌の集合体」という幻想が守られてきました。そこで、最新技術である「メタゲノム解析」（メタ16S解析とメタITS解析）により、網羅的に構成微生物を調べました。EM菌の様々な特殊効果を出しているとされる「光合成細菌」は検出されず、主要な微生物の種類も実際に検出されたものとは異なっていました。また、EM菌培養液に含まれる微生物の多くは「雑菌」でした。EM菌の正体が分かってみれば、その万能性に対する幻想は薄まると期待しています。

※この一連の解析は資金的な背景を疑われないように全て私財を投じて行っています。
　以前、ある学会がEM菌に関する研究報告をした際に、EM側と敵対していた団体から研究費を寄付されていたことで、EM菌に批判的な結果は疑わしいとして反論材料にされてしまいました。そこで、この解析はそうした謗りを受けないように全て自費で行っています。解析費用の他に実験材料や器具、顕微鏡などの機材を購入したので、総費用は約70万円ほどになりました。本格的な検証には費用がかかるのと専門知識がいるので、誰もが手軽にできることではないのですが、こうした「検証活動」に賛同してくださる方々が多ければ、他にもこうした活動を試みようとする動きに繋がると思います。よろしければ「サポート」をお願い致します。m(_ _)m

※解析結果を第三者が検証できるように「メタゲノム解析」の生データ（ampliconデータ：fastq）をUPしておきます。
　注：このデータ解析には専用ツールと専門知識が必要です。
https://drive.google.com/drive/folders/1b7hc_gq8DqA4aiFKEkWzm4VWOr62-3IN

メタゲノム解析で判明したEM菌（微生物資材EM1）を構成する微生物

先に結果を示します。

判明したEM1の主要構成微生物

※EM1（EM菌の基本的なタイプ）に入っているとされる種類の「光合成細菌」は検出されませんでした。
　EM菌に含まれるはずの「光合成細菌」が実は存在していないという報告がこれまでにも多数出されてきましたが、EM菌の開発者である比嘉照夫氏は「極めて初歩的な平板希釈法という微生物の検出方法では、光合成細菌が検出されるのは、EM・3のみで、EM・1やEM・2からは検出されない」「EM・1はpHが3.5以下という強い酸性下にあるため、光合成細菌はシスト状態となり、休眠的になっており、施用後に発芽的に再生し、増殖します。この場合、乳酸菌や酵母等は、その作用を著しく増強しますが、糖蜜等で活性化（培養）し太陽に当てると赤くなります。この時点で調べると光合成細菌は多数検出されます。それでも不可であればメタゲノム分析をしてください。」と反論していました。（引用元：https://www.ecopure.info/rensai/teruohiga/yumeniikiru103.html ）
　そしてEM関連業者から、EM1に含まれる「光合成細菌」として、Rhodopseudomonas Palustris とRhodobacter Sphaeroidesの２種類が公表されていました。しかし、今回の実験&解析で「EM1を糖蜜で太陽に当てながら培養したもの」を「メタゲノム分析（解析）」しましたが、やはりどちらの光合成細菌も検出されませんでした。その他の光合成細菌についても、EM1の構成微生物として検出されたものはありませんでした。

　同様に、EM関連業者からEM菌に含まれている乳酸菌はLactobacillus PlantarumとLactobacillus Caseiであると公表されていましたが、実際に検出されたのは上記2種類とは異なるLactbacillys parafarraginisであり、主要乳酸菌に関してもEM側の情報が怪しいことが裏付けられました。

EM菌の培養

【実験材料】

※EM1は、容器の下に沈んだ微生物があるかもしれないので、よく混ぜて均一にしてから使用しました。

【実験方法】

構成微生物の解析概要

EM菌を構成する細菌の解析方法

V3-V4領域アンプリコンシーケンス
・プライマー配列
V3-V4_F：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
V3-V4_R：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT
・PCR条件
DNAポリメラーゼ：KAPA HiFi HotStart ReadyMix

（↑解析委託業者の報告レポートより）
NGS解析には各左端のレーンのPCR産物を使用しました。

NGS解析
・PhiX：30%添加
・シーケンサー：MiSeq（イルミナ社）
・解析パイプライン：QIIME2　詳細なパラメータ設定は省略

EM菌を構成する細菌の種類と割合

※「糖蜜培養液」は対照試料です（「EM菌なし」のブランク）。
最新のQIIME2で再解析した結果のみ示します。

EM菌を構成する真菌の解析方法

EM菌を構成する細菌の解析方法
ITS領域アンプリコンシーケンス
・プライマー配列
fITS7：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGAATCATCGARTCTTTG
ITS4：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC

・PCR条件
DNAポリメラーゼ：MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3

（↑解析委託業者の報告レポートより）
NGS解析には各左から2番目のレーンのPCR産物を使用しました。

NGS解析
・PhiX：25%添加
・シーケンサー：MiSeq（イルミナ社）
・解析パイプライン：QIIME　詳細なパラメータ設定は省略

EM菌を構成する真菌の種類と割合

※「糖蜜培養液」は対照試料です（「EM菌なし」のブランク）。

EM菌を健康法として使用している愛好者への注意喚起

EM菌を加えた培養液中にアシネトバクター属のAcinetobacter ursingiiが増えていました。この細菌は「日和見感染菌」として血液感染症から比較的高頻度で検出されています。
※EM菌培養液（EM活性液）を「非加熱で飲食」したり、「点眼」や「肺に吸入」したり「膣洗浄」するなどの行為が一部で健康に良いとして広められていますが、特に易感染者（持病等により免疫系が弱っている方々、高齢者、乳幼児など）は止めておいた方が良いと考えます。

補足：光合成細菌の検出ができるかどうかについて

EM1に入っているとされる2種類の「光合成細菌（紅色非硫黄細菌）」の16S rRNA遺伝子配列とV3V4領域のPCRプライマー配列の一致（Blast解析）

→（理論上）存在していればPCRで増幅されて検出されます

・プライマー配列のV3V4領域部分
V3-V4_F：CCTACGGGNGGCWGCAG
V3-V4_R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT
※「N」はA,C,G,Tの混合、「W」はA,Tの混合、「H」はA,T,Cの混合、「V」はA,C,Gの混合

・Rhodopseudomonas Palustris
V3-V4_Fとの比較：NとWにはAが含まれているので「一致」

V3-V4_Rとの比較：HにはC、WにはAが含まれているので「一致」

・Rhodobacter Sphaeroides
V3-V4_Fとの比較：NとWにはAが含まれているので「一致」

V3-V4_Rとの比較：HにはC、VとWにはAが含まれているので「一致」

解析費用（業者からの請求書公開）

解析費用の総額は以下の通り615,600円です。
これに、実験材料や培養用のビン等の器具、顕微鏡等の機材の購入費を加算すると約70万円になりました。

細菌の解析は、その後、より正確に解析できるQIIME2がリリースされたので、NGS解析によって得られたアンプリコンシーケンスデータ（fastq）をさらに精度が高いデータベースと組み合わせて再解析をしました。